Etude de nouveaux rôles de la DNA-PKcs, indépendants de NHEJ, dans la sensibilité aux inhibiteurs de Topoisomérase I de la famille des camptothécines

The Nonhomologous End-Joining (NHEJ)-Independant Association of DNA-PKcs with Topoisomerase I alters cell sensitivity to Camptothecin

• Auteur / Autrice : Michel Théodore Tautu
• Direction : Philippe Pourquier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et médicales. Biologie - Santé
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Bordeaux 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phosphotransférases

Camptothécine

Cancer -- Thérapeutique

Inhibiteurs

Topoisomérase I

Résumé

La Topoisomérase 1 (Top 1) est une enzyme nucléaire essentielle à la plupart des transactions de l'ADN. Elle est la cible privilégiée des camptothécines (CPT) qui sont très utilisées en chimiothérapie. Ces poisons stabilisent les complexes covalents ADN-Top 1 qui sont transformés en cassures cytotoxiques au cours de la phase S dy cycle cellulaire. Plusieurs études ont montré que des cellules sans DNA-PKcs, une kinase essentielle à la réparation de l'ADN par recombinaison non-homologue (NHEJ), étaient hypersensibles à la CPT et suggéraient que cela était dû à une déficience en réparation. Dans ce travail, nous démontrons que c'est l'absence physique de la DNA-PKcs et non la perte de son activité kinase essentielle au NHEJ qui est à l'origine de la plus grande sensibilité des cellules DNA-PKcs-/-à la CPT, par un mécanisme impliquant l'absence d'interaction entre la DNA-PKcs et la Top1. La DNA-PKcs, sans les protéines Ku70 et Ku80 est en effet capable de le lier au domaine N-terminal de la Topo1 et inhibe son activité de coupure et de relaxation de l'ADN in vitro. Nous montrons également que dans les cellules DNA-PKcs-/-où cette interaction n'e'st pas possible, il existe un niveau basal plus élevé de complexes de clivage Top1-ADN que dans les lignées DNA PKcs+/+, qui est restauré lorsque le niveau de Topo 1 est régulé à la baisse ou en présence de substrats spécifiques de DNA-PKcs. Nos données mettent en évidence un nouveau rôle de ''scaffold protein'' de la DNA-PKcs et supportent un modèle dans lequel l'interaction entre DNA-PKcs et Topo 1 permettrait de réguler la disponibilité de Topo 1 libre susceptible de former des complexes avec l'ADN.

DNA topoisomerase 1 (Top 1) is a conserved nuclear enzyme that constitutes the cellular target of the camptothecin (CPT) class of chemotherapeutics. These drugs reversibly stabilize covalent Top1-DNA intermediates, which are converted into potentially lethal DNA lesions during S-phase. The enhanced CPT sensitivity of mammalian cell lines that are deficient for DNA-PKcs, the catalytic subunit of DNAdependent protein kinase, suggests that error-prone nonhomologous end joining (NHEJ) is a critical determinant of tumor cell sensitivity to drugs that poison Top1. However, contrary to this view, we report that the loss of the DNA-PKcs protein scaffold, rather than DNA-PK kinase activity, enhances mammalian cell sensivity to CPT. DNA-PKcs associated with the N-terminal domain of Top1, in the absence of Ku70 and Ku80, to suppress DNA cleavage by Top1. Interestingly, DNA-PKcs (-/-) cells exhibited increased basal levels of covalent Top1-DNA complexes, which were abolished by siRNAtargeted downregulation of Top1. Our data support a model whereby DNA-PKcs binding to Top1 limits DNA binding and consequently, the levels of covalent Top1-DNA complexes in vivo. This NHEJ-independent regulation of Top1 catalysis directly impacts cell sensitivity to CPT by regulating the steady state levels of the cellular target of this important class of chemotherapeutics. Moreover, we posit that this mechanism impacts cellular responses to other genotoxic stress, such as ionizing radiation and oxidative damage, that can also induce endogenous Top1-DNA adducts.