Histones désacétylases et cancer du pancréas

Histone deacetylases and pancreatic cancer

• Auteur / Autrice : Mehdi Ouaïssi
• Direction : Jean-Paul Bernard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Nutrition. Sécurité Alimentaire
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche en Oncologie biologique et Onco-pharmacologie (Marseille)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tumeurs du pancréas

Adénocarcinome

Cancer

Pancréas

Cancérogenèse

Histone deacetylases

Résumé

Nos travaux ont débuté par une étude bibliographique portant sur le rôle des HDAC dans la carcinogenèse et l’utilisation des inhibiteurs en thérapeutique. L’implication des histones désacétylases (HDAC) dans le processus de carcinogenèse de certains cancers digestifs est maintenant bien établie. Cependant leur rôle dans le cancer du pancréas n’a a ps encore été exploré. Le but de la première partie du travail a été d’évaluer le niveau d’expression des histones désacétylases dans 4 lignées cellulaires de cancer du pancréas et de déterminer leur niveau de sensibilité à différents inhibiteurs d’histones désacétylases (HDIs) : TSA, Nicotinamide, et Sirtinol. Les niveaux d’expression des gènes HDACs sont légèrement différents entre lignées cellulaires. De même, la PCR quantitative en temps réel a montré que les niveaux d’expression de ces gènes sont en deçà de celui d’un gène de ménage. En revanche, Le niveau de synthèse des protéines HDACs semble être comparable. Par ailleurs, les inhibiteurs des HDACs exercent une activité anti-proliférative sur les lignées pancréatiques. En utilisant différentes techniques, nous avons observé que les HDIs induisaient une fragmentation de l’ADN, une altération du cycle cellulaire, une externalisation des groupements phosphatidyl-sérine, et une perte du potentiel mitochondrial, l’ensemble conduisant à une mort cellulaire par apoptose. Nos résultats suggèrent que la sensibilité des cellules aux inhibiteurs n’est pas en relation avec le niveau d’expression des HDACs mais dépend vraisemblablement d’autres gènes parmi eux probablement ceux qui contrôlent le cycle cellulaire. La deuxième partie du travail a porté sur l’évaluation du niveau d’expression des gènes codant pour des membres de différentes classes de HDAC (Classe I, II, III) dans les tissus pancréatiques prélevés sur des pièces opératoires. L’extraction d’ARN a été réalisée sur 11 adénocarcinomes du pancréas (AP) de différents stades : 0 (n=1), IB (n=1), IIB (n=6), III (n=1), IV (n=2); 4 tumeurs bénignes [1 cystadénome séreux (CS), une tumeur intracanalaire mucineuse pancréatique (TIPMP), une pancréatite chronique (PC), et un pancréas normal obtenu lors d’un prélèvement d’organe. La RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction) et la PCR quantitative nous ont permis d’évaluer le niveau d’expression des gènes d’intérêt. Une analyse semi-quantitative du niveau de synthèse des protéines HDAC a été réalisée par Western blot et leur localisation par étude immunohistochimique sur coupes de tissu pancréatique. L’analyse par Western bot de la réactivité des extraits tissulaires vis-à-vis d’anticorps spécifiques dirigés contre des membres de la famille des HDAC de classe I, II et III, montre un certain degré de complexité des polypeptides immunoréactifs. Cependant, une forte immunoréactivité des anticorps anti-HDAC7 est observée dans près de 81% des adénocarcinomes (9/11) comparativement aux tumeurs bénignes (CS, TIPMP, PC) et pancréas normal. Cette forte synthèse d’HDAC7 est corroborée par les résultats de la PCR quantitative en temps réel qui montre une forte augmentation de l’expression du gène HDAC7 dans les 9 adénocarcinomes du pancréas. En revanche, des prélèvements proches ou à distance de la tumeur pancréatique ont montré des niveaux d’expression des gènes HDAC similaires au pancréas normal. L’étude immunohistochimique sur coupe d’adénocarcinome pancréatique montre une forte réactivité des anticorps anti-HDAC7. Conclusion: Ces observations sont en faveur de l’expression différentielle du gène HDAC7 dans le cancer du pancréas et suggèrent que HDAC7 pourrait constituer un marqueur potentiel. Des travaux récents ont montré que le vorinostat, un inhibiteur des HDAC, cible spécifiquement HDAC7. Nos résultats, s’ils sont confirmés sur une large série d’adénocarcinomes de différents stades, pourraient constituer une base solide pour envisager le développement de stratégie thérapeutique ou adjuvante nouvelle pour le cancer du pancréas.

In the first part of the work we analyze some of the current data related to the deacetylase enzymes as a possible target for drug development in cancer. Given the structural differences among members of this family of enzymes, development of specific inhibitors will not only allow selective therapeutic intervention, but may also provide a powerful tool for functional study of these enzymes. In the second step, attempts were made for the first time to explore the level of expression of members of histone deacetylase encoding genes (HDACs) in four pancreatic tumor cell lines: Panc-1, BxPC-3, SOJ-6 and MiaPaCa-2; and two non-related tumor cells: Jurkat and HeLa. The possible relationship between the levels of HDACs expression and the sensitivity/resistance to HDAC inhibitors (TSA, Nicotinamide and Sirtinol) was further analyzed. Although a slight variation in the profiles of gene expression among cell lines could be evidenced, HDACs protein synthesis seem to be similar. Furthermore, the cells were equally sensitive to inhibition by Sirtinol whereas some variation in the IC50 could be seen in the case of TSA. We also demonstrate that the drugs had the capacity to induce the death of cells by apoptosis. Taken together, our data support the notion that the level of cell sensitivity to the HDIs might be related to the level of expression of genes such as those encoding proteins playing a role in cell cycle checkpoints control but not HDAC per se. In a third part of work, we have evaluated the expression levels of members of class I, II and III in a set of surgically resected pancreatic tissues. Total RNA was isolated from 11 pancreatic adenocarcinomas (PA): Stage 0 (n=1), IB (n=1), IIB (n=6), III (n=1), IV (n=2), one serous cystadenoma (SC), one intraductal papillary mucinous tumor of the pancreas (IMPN), one complicating chronic pancreatitis (CP) and normal pancreatic biopsy (NP) obtained during donor liver transplantation. In addition, four samples of control tissues taken from the surgical specimens from different patients with PA, and two samples from patients with adenocarcinomas of biliary duct (BD) were also included in this study. Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was conducted and gene expression was quantified by qPCR. Protein expression levels were analyzed by Western blot and their localization by immunohistochemistry analyses of cancer tissues sections. The expression of class I and II members of HDACs showed that all the samples from PA, CP, SC and IMPN had decreased levels of HDAC 1, -2, -3 and -4 transcripts. Remarkably, 9 of the 11 PA (≅ 81%) showed significant increase of HDAC7 mRNA levels. The Western blot analysis showed increased expression of HDAC7 protein in 9 out of 11 PA samples in agreement with the qPCR data. Most of the PA tissue sections examined showed intense labeling in the cytoplasm when reacted against antibodies to HDAC7. The data showed alteration of HDACs gene expression in pancreatic cancer. Therefore, increased expression of HDAC7 discriminates PA from other pancreatic tumors.