Mécanismes de transfection par la polyethylenimine : influence de la PEGylation

• Auteur / Autrice : Marion François
• Direction : Jean-Paul Behr, Jean-Serge Remy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)

Résumé

Le concept de thérapie génique, défini par l'utilisation d'acides nucléiques en tant que médicament, a émergé il y a une trentaine d'années. C'est un concept très attractif, puisque contrairement aux traitements palliatifs, elle permettrait la guérison de pathologies génétiques héréditaires, d'affections acquises, de maladies dégénérescentes ou encore d'infections virales. La mise en oeuvre de la thérapie génique nécessite une vectorisation de l'ADN afin de transporter les acides nucléiques dans le noyau des cellules en utilisant des systèmes de délivrances (vecteurs) d'origine naturel ou synthétique. Si les vecteurs viraux sont efficaces, ils sont délicats à produire et ont montré des propriétés immunogènes et oncogéniques. Les systèmes de délivrance synthétique actuels sont par contre beaucoup plus faciles à produire et offrent des perspectives de modification. Parmi ces vecteurs non-viraux, la polyéthylènimine linéaire de 22 KDa (L-PEI) de masse molaire a été la plus étudiée in vivo en raison de sa grande efficacité (pour un vecteur de synthèse. . . ). Dans ce travail de thèse, nous avons entrepris de recouvrir les polyplexes avec des éléments de protection pour augmenter la résilience des particules in vivo. Pour cela, nous avons d'abord modifié chimiquement de la L-PEI par du N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio) propionate pour former un polymère fonctionnalisé, le PEI-POP. Nous avons ensuite formé des complexes PEI-POP/ADN de petites tailles et nous les avons recouverts de molécules de PEG par formation de pont disulfure. Nous avons abouti à un protocole fiable et reproductible et obtenu des polyplexes marqués par des fluorophores. Finalement, nous avons étudié, la visualisation de nos polyplexes en cellules vivantes par microscopie confocale, le suivi et le tri par FACS des différentes populations de cellules ainsi que le devenir de l'ADN dans la cellule. Toutes ces études ont été faites en parallèle sur des polyplexes PEGylés et non PEGylés. Cela nous a permis de constater que la transfection est maximale 24 à 48h après application des complexes mais que le phénomène persiste jusqu'à 8 jours. Aussi, des cellules non transfectées peuvent devenir transfectées jusqu'à plus de 4 jours post transfection ou encore que certaines cellules passent du statut de transfectées à celui de non transfectées pour redevenir transfectées.

Concept of gene therapy emerged 3 0 years ago and is defi ned as the use of n ucleic acids as drugs and. This concept is very attractive since it should cure hereditary genetic pathologies, acquired or degenerative diseases, viral infections by contrast with palliative cares. Vectorisation allows DNA to be compacted into small particles which can penetrate cells and reach their nucleus. Besides viral vectors, which can cause immunogenic and oncogenic problems, non-viral vectors offers safer use and other advantages. They are easier to produce, they can be chemically modified and they can incorporate larger nucleic acids. Among known non-viral vectors, we have worked with linear polyethyleneimine 22K which seems to be both the most powerful synthetic vector and the one which exhibits the best in vivo results. During this PhD work, we first chemically modified this L-PEI with SPDP (N-succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)propionate). Such modification allowed to bind PEG molecules containing a terminal thiol moiety after the polyplex formation. We chose a postPegylation pathway to prevent DNA condensation problems which occur with prePEGylation. We purified our polyplexes at every stage to get rid off excess PEG and released thiopyridone. We set up a reliable and reproducible protocol which also allowed us to label polyplexes with fluorophores. Such fluorophores allowed visualization of the polyplexes inside living cells with confocal microscopy, FACS sorting of different cell strains and observation of DNA fate within cells. That study was carried out both with PEGylated and nonPEGylated polyplexes. We observed that transfection is a long-lived phenomenon (up to 8 days posttransfection), that cells can become transfected up to 4 days after transfection and that some transfected cells became non-transfected and transfected back.