Sondes fluorescentes ratiométriques dérivées de la 3- Hydroxyflavone : Etude spectroscopique de nouveaux dérivés et applications en biophysique membranaire

Ratiometric fluorescent probes derived from the 3-hydroxyflavone : Spectroscopic study of new derivatives and applications in membrane biophysics

• Auteur / Autrice : Gora M’Baye
• Direction : Guy Duportail
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Biophysique
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microdomaines membranaires

Sondes fluorescentes

Fluorescence

Spectroscopie de fluorescence

Membrane cellulaire

Biophysique

Résumé

Les dérivés de la 4’-dialkylamino-3-hydroxyflavone (3HF) sont apparus très intéressants comme sondes fluorescentes ratiométriques étant donné leur fluorescence duale résultant d’une réaction de transfert intramoléculaire de proton à l’état excité. La position des maxima de fluorescence et le rapport d’intensité des formes tautomères N* et T* varient en fonction de la polarité, de la facilité à former des liaisons hydrogène et de l’hydratation de l��environnement. En outre, leur caractère hydrophobe en fait des sondes membranaires idéales. Dans ce travail nous avons d’abord étudié de nouveaux dérivés. Le premier dérivé est la 2-[4-di(2-hydroxyéthyl)aminophényl]-3-hydroxy-4H-4-chromenone (FHE), pourvue de deux groupements hydroxyéthyl permettant son ancrage au niveau de la membrane sans nécessité d’une interaction électrostatique. L’étude de FHE dans les solvants et les liposomes a montré que cette sonde est solvatochromique, sensible au potentiel dipolaire et à la présence de polyanions tels que l’ATP. Elle présente la particularité de ne pas posséder de forme hydratée. Nous avons ensuite étudié deux dérivés pour lesquels le noyau phényle a été remplacé par le noyau thiophène. Leur étude dans les solvants et les liposomes a montré leur grande sensibilité à la basicité du solvant et un excellent rendement quantique. L’intérêt majeur de ces sondes est leur grande sensibilité au potentiel membranaire de surface ainsi qu’un déplacement des spectres d’absorption vers le rouge, permettant ainsi leur utilisation à l’excitation avec des sources laser conventionnelles. La dernière partie du travail a porté sur l’application de telles sondes en biophysique membranaire. Nous avons d’abord confirmé l’applicabilité des sondes 3-HF à la mesure du potentiel dipolaire membranaire en prenant en compte leur forme hydratée dont l’interférence possible dans la mesure était jusqu’alors ignorée. Enfin, nous avons pu montrer pour la première fois la différence d’hydratation entre une phase liquide ordonnée caractéristique des radeaux lipidiques (sphingomyéline + cholestérol) et une phase gel classique (sphingomyéline seule), l’hydratation se révélant nettement moins importante dans le cas de la phase liquide ordonnée.

Derivatives of the 4'-dialkylamino-3-hydroxyflavone appeared particularly interesting as fluorescent probes in regard to their dual fluorescence resulting from an excited state intramolecular proton transfer reaction. The position of their fluorescence maximum as well as the intensity ratio of N* and T* tautomer forms vary according to the polarity, the ability to form hydrogen bonds and the hydration of the environment. Their hydrophobic character is making them ideal membrane probes. In this work we first studied new derivatives. The first one is 2-[4- di(2-hydroxyéthyl)aminophenyl]-3-hydroxy-4H-4-chromenone (FHE), with two hydroxyethyl groups allowing the anchoring of the probe at the membrane interface without the need of any electrostatic interaction. The study of FHE in solvents and liposomes showed its solvatochromicity, its sensitivity to dipole potential and to the presence of polyanions (ATP), and also the absence of any hydrated form. Then, we studied two derivatives in which the phenyl ring was replaced by a thiophene ring. Their study in solvents and liposomes showed a greater sensitivity to the basicity of the solvent and an improved quantum yield. The main advantage of these probes is their great sensitivity to the surface membrane potential and their red-shifted absorption, making them excitable by conventional laser sources. The last part of the work concerned the application of 3-HF derivatives in membrane biophysics. First, we confirmed the applicability of these probes for the measurement of the membrane dipole potential by taking into account their hydrated form, which was up to now ignored. Finally, we were able to show for the first time the difference in hydration between the liquid ordered phase (sphingomyelin + cholesterol) characterizing the lipidic rafts and the classical so-called gel phase (sphingomyelin alone), the liquid ordered phase being clearly less hydrated.