Mécanismes Moléculaires par lesquels le pH acide augmente la stabilité de l'ARNm du cotransporteur BSC1

Molecular mechanisms involved in the acid pH-increased mRNA stability of BSC1/NKCC2 cotransporter

• Auteur / Autrice : Marta Szutkowska
• Direction : Karim Zoubida, Gérard Friedlander
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie et Pathologie des Epithéliums
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Symporteurs des ions sodium-potassium-chlorure

Cristallines-zêta

ARN messager

Acidose

Stabilité de l'ARN

Résumé

BSC1 est le transporteur majeur de NH4+ dans la branche large ascendante de l'anse de Henle (MTAL). Il joue un rôle important dans la régulation rénale du bilan acido-basique de l'organisme. L'acidose métabolique stimule BSC1 en augmentant l'abondance de son ARNm et de sa protéine. Le pH acide augmente la stabilité de l'ARNm du BSC1 en agissant sur sa partie 3' non traduite (3'-UTR). ζ-cristalline (ζ-cris) et HuR sont deux protéines qui stabilisent les ARNm en se fixant sur des motifs AUUUA (AREs). Notre projet était de déterminer un rôle éventuel de ζ-cris et de HuR dans l'augmentation de la stabilité de l'ARNm du BSC1 par 1 pH acide. La présence de ζ-cris et HuR est déterminée par Western Blot et microscopie confocale. Six mutants sont obtenus par délétion des AREs et l'abondance des ARNm du BSC1 sauvage (WT) ou mutés est mesurée par Slot Blot et RT-qPCR. Nos résultats sont : 1) La délétion de 4 motifs sur 6 diminue la stabilité de l'ARNm du BSC1. L'effet le plus marquant est observé pour le motif ARES (position : 4350). ARE3 et ARE6 (position : 4491) sont responsables de l'effet du pH acide. 2) ζ-cris est présente dans la MTAL et les cellules TAL. Son abondance est augmentée par le pH acide. La sur-expression de ζ-cris stimule, alors que son invalidation inhibe, aussi bien l'expression du BSC1 WT que l'effet du pH. Les motifs ARE2 et ARE3 sont des motifs cibles de ζ-cris. 3) HuR est présente dans la MTAL et les cellules TAL. Le pH acide stimule HuR par translocation di noyau vers le cytoplasme. L'invalidation de HuR inhibe l'effet du pH acide. L'ARNm du BSC1 coimmunoprécipite avec HuR dans des complexes ARNm/protéines mais les ARE cibles de HuR restent à déterminer.

Transport of NH4+ via the medullary thick ascending limb (MTAL)-specific BSC1 cotransporter is critical for acid excretion by the kidney. Metabolic acidosis enhances mRNA and protein abundances of BSC1. We have shown that acidic pH increases mRNA stability of BSC1 via involvement of the 3'untranslated region (3'UTR). Ç-crystalline (ζ -crys) and HuR are proteins that bind AUUUA motifs (ARE) and protect mRNAs from degradation. Here, we determine the role of the 3'UTR-containing ARE and of ζ -crys and HuR in acid pH- increased stability of BSC1. ζ -crys and HuR were detected by Western Blot and confocal microscopy. BSC1 mutants were generated by deletion of ARE and the abundance of BSC1 WT and mutants mRNAs were quantified by Slot Blot or RT-qPCR. We report: 1 Deletion of 4 out of 6 AREs decreased the stability of BSC1. The most relevant effect was observed for the ARE3 (position: 4350, 86% losing). ARE3 and ARE6 (position: 4491) are responsible for pH effect. 2 ζ -crys is expressed in both MTAL tubules and TAL cells and its abundance is induced by acidic pH. Overexpression of ζ -crys increased the stability of WT but not the mBSC1 Δ 3'UTR mRNA. Moreover, acid pH failed to induce any additional effect on BSC1 in cells overexpressing ζ -crys. RNAi-silencing of ζ -crys resulted in an inhibition of BSC1 expression and acid pH effect. ARE2 and ARE3 are the targets of ζ -crys. 3 HuR is expressed in MTAL and TAL cells, and acid pH stimulates its shuttling from nucleus to cytoplasm. Silencing of HuR inhibited acid pH effect. BSC1 mRNA is co-immunoprecipitated with HuR antibody in purified mRNA /proteins complexes but the interaction of HuR with specific ARE remains to be determined.