Détermination de la structure en solution de deux domaines de la protéine ribosomique S1 et étude phylogénétique des domaines S1 : Mise en évidence d'un complexe ternaire RegB/S1/ARN dans la coupure des ARN par RegB

NMR structure determination of two domains of the ribosomal protein S1 and phylogenetics studies of S1 domains : characterisation of a ternary complex RegB/S1/ARN-cleaving by RegB

• Auteur / Autrice : Philippe Salah
• Direction : François Bontems
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique moléculaire
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN messager

Bactériophage T4

Endoribonucleases

Protéines Escherichia coli

Protéines ribosomiques

Résumé

La protéine SI est essentielle à la machinerie traductionnelle chez les bactéries Gram-négatives, les cyanobactéries et chez certains chloroplastes. Son activité consiste principalement à faciliter la reconnaissance par le ribosome d'ARN messagers ne possédant pas une région Shine-Dalgarno canonique. Par ailleurs, SI est détournée par des agents pathogènes dans le cas d'infection de certains phages. Il a notamment été montré que SI augmente in vitro d'un facteur 100 l'activité hautement spécifique de l'endoribonucléase RegB du phage T4. RegB est impliquée dans l'inactivation des ARNm de la phase précoce du cycle de vie du phage : elle clive spécifiquement les ARNm au niveau de la région Shine Dalgarno. Le couple RegB/Sl constitue ainsi pour le laboratoire un système modèle du contrôle de la durée de vie des ARN messagers. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons, dans un premier temps, déterminé par RMN les structures des domaines 4 et 6 de la protéine SI. Dans un deuxième temps, nous avons déterminé une sous-classification des domaines SI. Finalement, nous avons réalisé une série d'expériences RMN destinées à caractériser le complexe ternaire RegB/Sl/ARNm.

The ribosomal protein S1 is essential to the initiation of translation in gram-negative bacteria. S1 is also used, at their own profit, by several bacteriophages. In particular, it accelerates the reaction rate of the phage T4 ribonuclease RegB, which specifically inactivates some of the phage early messenger RNAs by cleaving them in the middle of the GGAG sequence found in their translation initiation region. We are interested in analyzing the way S1 accelerates RegB reaction. The laboratory already identified the region of S1, formed of three conserved domains, responsible for RegB acceleration. It also showed the lifetimes of RNA-S1 and RNA-RegB complexes are short and characterized their interaction surfaces. No complex between RegB and SI could be identified. In these conditions, we wondered whether the acceleration of RegB by SI is due to the formation of a ternary complex or whether it involves a catalytic action of SI on the RNAs. To answer this question, first we solved, by NMR, The structure of two S1 domains, the 6th and 4th. We choose the domain 4 for the central position in the RegB activating domain, and the 6th domain to create a relative close model for the other domains. Second, we created a new classification of S1 domains by bioinformatics analyses. Finally we start to study the interactions between RegB, SI and some oligoribonucleotides. By simply comparing 1H-15N HSQC and HNCO experiments recorded on RegB/RNA, Sl/RNA, RegB/Sl and RegB/Sl/RNA mixes, we characterize the formation of a ternary complex.