Développement de vecteurs lentiviraux non-intégratifs en vue du transfert de gènes dans le système nerveux central

Development of non intecrative lentiviral vectors for cene transfer into the central nervous system

• Auteur / Autrice : Stéphanie Philippe
• Direction : Jacques Mallet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Thérapeutiques biotechnologiques
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Système nerveux central

Génome viral

Rats

Integrases

Techniques de transfert de gènes

méthodes

Thérapie génétique

Lentivirus

Résumé

Dans le but de réduire le risque de mutagenèse insertionnelle lié à l'intégration du génome des vecteurs lentiviraux dans la chromatine de la cellule cible, nous avons développé des vecteurs lentiviraux dépourvus de capacité d'intégration par introduction d'une mutation dans la région N du domaine C-terminale de Fintégrase de vecteurs dérivés du HIV. Le phénotype épisomal de ces vecteurs a été confirmé. Nous avons également démontré qu'ils permettent l'expression d'un transgène GFP in vitro dans différentes lignées cellulaires et dans des cultures primaires de cellules en arrêt de division ainsi que in vivo dans le système nerveux central de rongeur (au moins 5 mois d'expression après injection sous rétinienne chez le rat). Afin d'améliorer l'efficacité de transcription I des formes épisomales, nous avons introduit dans le génome des séquences d'attachement à la matrice nucléaire. Nous n'avons toutefois observé aucun effet sur l'expression du transgène. Nous avons ensuite produit des vecteurs portant différentes mutations d'intégrase (N, LQ et D64''V). Nous avons établi in vitro que le vecteur N est moins efficace que les vecteurs D64V et LQ qui permettent une expression comparable du transgène. Nous avons enfin produit des vecteurs portant ces différentes mutations d'intégrase seules ou en combinaison avec la modification des séquences att des LTR et nous avons comparé leur fréquence d'intégration résiduelle. Nous avons observé que le vecteur D64-V présente la fréquence d'intégration la plus élevée parmi les vecteurs mutants. Par ailleurs, nous n'avons pas observé de réduction significative de l'intégration par la modification des LTR.

With the aim of reducing the risk of insertionnal mutagenesis risk due to the integration of the genome of the lentiviral vectors into the chromatin of the target cells, we developed lentiviral vectors deprived of their capacity of integration through introduction of a mutation into the N motif of the C-terminal domain of the integrase coding sequence of vectors derived from HIV. The episomal phenotype of these vectors was confirmed. We also showed that they allow the transgene expression in vitro in varions cell lines and primary cultures of non dividing cells, and in vivo in the rodent central nervous System (at least 5 months of expression after subretinal injection in the rat). In order to improve the transcription efficiency of the episomal forms, we introduced into the vector genome nuclear matrix attachment sequences. However, we did not observe any effect on the transgene expression. We then produced vectors carrying varions integrase mutation (N, LQ and D64V). We established in vitro that N mutant vector is less effective than D64V and LQ mutant vectors, which allow a comparable transgene expression. We finally produced vectors carrying these varions integrase mutation combined or not with the modification of the att sequences of the LTR and we compared their residual integration frequency. We observed that D64V mutant vector presents the highest integration frequency among the mutant vectors. In addition, we did not observe any significant reduction of integration by the modification of the LTR.