Aminopeptidase B : modélisation moléculaire et étude du site actif par mutagenèse dirigée

Aminopeptidase B : Molecular modeling and mutational analysis of the active site

• Auteur / Autrice : Viet-Laï Pham
• Direction : Thierry Foulon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés libres

Maturation hormonale

Glucagon

Leucotriène A4 hydrolases

Famille M1

Neuropeptide

NRD convertase

Résumé

L’aminopeptidase B (Ap-B ; EC 3. 4. 11. 6) hydrolyse les acides aminés basiques en N-terminal de peptides et est impliquée dans la maturation d’hormones et probablement de neuropeptides selon un mécanisme original récemment mis en évidence. À ce jour, un seul de ses substrats physiologiques a été identifié, le glucagon qui, de par l’action successive de la NRD convertase puis de l’Ap-B, est transformé en miniglucagon. Ces deux hormones participent à la régulation de l’homéostasie du glucose chez les Mammifères. Une autre particularité de l’Ap-B est de présenter, in vitro, une activité résiduelle de type e��poxyde hydrolase, capable d’hydrolyser le leucotriène A4 (LTA4) en leucotriène B4, un médiateur lipidique de l’inflammation. A l’inverse, son plus proche parent phylogénétique, la Leucotriène A4 Hydrolase (LTA4H ; EC 3. 3. 2. 6) possède, en plus de son activité époxyde hydrolase, une activité aminopeptidase toutefois moins spécifique. Une analyse structurale et fonctionnelle de l’Ap-B est nécessaire pour mieux comprendre les mécanismes catalytiques de l’enzyme et pour parvenir à la conception d’inhibiteurs spécifiques, dont l’utilisation devrait nous éclairer sur l’ensemble de ses fonctions in vivo. Nous avons mis au point un système d’expression et de purification de l’Ap-B chez E. Coli avant d’entreprendre une analyse fonctionnelle par mutagenèse dirigée d’un certain nombre de résidus potentiellement impliqués dans l’activité de l’enzyme. Ces acides aminés ont été identifiés par alignement des séquences des protéines de la famille M1 à laquelle appartiennent l’Ap-B et la LTA4H. Cette étude a, par ailleurs, permis d’identifier 3 sous-familles distinctes d’aminopeptidases. Cette famille M1 est caractérisée par la présence d’un motif de fixation du cation Zn2+ de type HEXXHX18E. Les mutations des résidus de ce motif conduisent à une perte totale de l’activité de l’Ap-B, confirmant ainsi le rôle essentiel de ces résidus dans le mécanisme catalytique. La famille M1 est également caractérisée par la présence d’un second motif consensus (GXMEN). Nous avons également muté l’ensemble des résidus de ce second motif. Si les mutations des acides aminés M, E et N conduisent à une perte de l’activité, les mutations du résidu G en sérine ou proline donnent naissance à deux protéines actives. Le mutant G298S a des propriétés proches de l’enzyme sauvage, tandis que le mutant G298P présente une modification de sa spécificité de substrat (clivage de R, K, P et A), de son profil d’inhibition et de son activité en présence d’ions Cl-. L’analyse de ces mutants par dichroïsme circulaire et spectrométrie de fluorescence montre que les structures globales de ces enzymes ne semblent pas perturbées. Dix autres acides aminés ont également été mutés et leur étude fonctionnelle est en cours. Les similitudes structurales et fonctionnelles de l’Ap-B et de la LTA4H dont la structure 3D est connue, nous a permis de construire un modèle moléculaire de la structure de l’Ap-B. Ce modèle a été utilisé pour, d’une part, essayer de comprendre le rôle du résidu Glycine du motif GXMEN et, d’autre part, pour mettre en évidence un certain nombre de différences entre l’Ap-B et la LTA4H, en particulier au niveau du site actif et des propriétés potentielles d’interactions protéine-protéines de l’Ap-B. En parallèle, nous avons mis au point un second système d’expression et de purification de l’Ap-B à partir d’un vecteur baculovirus et de cellules d’insectes. Ce système nous permet d’obtenir une quantité suffisante d’enzyme pour mettre au point les conditions de cristallogenèse de la protéine.

Aminopeptidase B (Ap-B ; EC 3. 4. 11. 6) cleaves basic residues at the N-terminus of peptides and participates in hormone and neuropeptide processing through an original mechanism recently described. The only known physiological substrate of Ap-B is the glucagon, which is processed into miniglucagon by NRD convertase and Ap-B. In mammals, these hormones are involved in the regulation of glucose homeostasis. One second characteristic of Ap-B is that the enzyme exhibits, in vitro, a residual ability to hydrolyze leukotriene A4 (LTA4) into the pro-inflammatory lipid mediator leukotriene B4. Inversely, LTA4 hydrolase (LTA4H ; EC 3. 3. 2. 6), the closest homologous protein of Ap-B, possesses, besides an epoxyde hydrolase activity, an aminopeptidase activity of broader specificity. Both proteins belong to the M1 family of Zn2+-aminopeptidases. A structure-function analysis is needed for a detailed understanding of the enzymatic mechanisms of Ap-B and to aid in the design of inhibitors, which could be used to determine its whole in vivo functions. In order to carry out a functional analysis by site-directed mutagenesis, we developed an expression system and a purification procedure of Ap-B using E. Coli. Amino acid residues potentially involved in the aminopeptidase activity are identified using alignments of primary structures of proteins from the M1 family. This study allowed us to identify 3 distinct M1 sub-families. This M1 family is characterized by the presence of a HEXXHXn=18E Zn2+- binding motif. Mutations of these residues lead to a total loss of activity and confirm their essential roles in catalysis. The major part of the M1 family members (Ap-B, LTA4H,…) constitutes the main sub-family and possesses a second consensus motif (GXMEN). Mutations of the M, E or N residues also lead to a total loss of aminopeptidase activity. Surprisingly, replacement of the conserved glycine into a serine or a proline created two new active enzymes. The G298S mutant exhibits properties similar to the wild type enzyme, whereas the G298P mutant shows a modification of its substrate specificity (recognizing R, K, P and A), its inhibition profile and its behavior towards Cl-. Fluorescence spectroscopy and circular dichroïsm analyses did not show any fundamental modification in the mutant structures. Ten other residues were mutated in the Ap-B primary structure and their functional studies are in progress. The sequence and catalytic similarities shared between Ap-B and LTA4H and the determination of the X-ray structure of LTA4H led us to build a 3D structural model of Ap-B. This model was used, on one hand, to better understand the enzymatic role of the glycine residue of the GXMEN motif and, on the other hand, to highlight functional differences between Ap-B and LTA4H, particularly at the level of their active site and of their proteinprotein interaction properties. In parallel, we also developed a second system of expression and purification of Ap-B using baculovirus and insect cells. This system allows us to purify a sufficient amount of protein for crystallogenesis assays.