Recherche Avancée

Thèse soutenue

Intéraction de la protéine EBNA-1 du virus Epstein-Barr avec l'ADN au niveau de l'origine de réplication latente : impact des protéines cellulaires HMGB

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Auteur / Autrice : Naïma Bouallag
Direction : Vincent Maréchal
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Microbiologie. Virologie fondamentale
Date : Soutenance en 2007
Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

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Dans les cellules infectées de façon latente par le virus Epstein-Barr, les génomes viraux persistent sous la forme d’épisomes multicopies. Leur maintien dans les cellules en prolifération est dépendant de deux éléments viraux seulement : la protéine EBNA1 et l’origine de réplication latente (OriP), qui contient deux régions comprenant respectivement 20 (région FR) et 4 sites de fixation pour EBNA1 (région DS). La fixation d’EBNA1, sous forme d’homodimères, à l’élément DS est nécessaire à l’initiation de la réplication. Son interaction avec FR (1) contrôle la ségrégation et le maintien des épisomes au cours des division cellulaires et (2) rend compte des propriétés transactivatrices qu’exerce EBNA1 sur des promoteurs viraux distants. Au cours de cette thèse, nous avons étudié l’effet d’une protéine cellulaire HMGB1, susceptible d’avoir une influence sur les interactions d’EBNA1 avec OriP. HMGB1 est une protéine nucléaire non-histone associée à la chromatine et capable de courber l’ADN linéaire in vitro. À ce titre, elle a été impliquée dans la réparation de l’ADN, la recombinaison et elle est également connue pour stimuler les interactions avec l’ADN de facteurs de transcription ou d’enzymes viraux ou cellulaires. Dans cette étude, la protéine EBNA1 et son domaine de dimérisation/fixation à l’ADN (région C-terminale) ont été exprimés dans E. Coli et purifiés à homogénéité. Les interactions de ces protéines avec l’ADN ont été analysées par retard sur gel en absence ou en présence d’HMGB1 purifiée dans E. Coli ou à partir de cellules eucaryotes. Nous montrons qu’HMGB1 augmente de façon très sensible la fixation du domaine C-terminal à la région DS ou à un site dérivé de la région FR. Cet effet est beaucoup moins sensible dans le contexte de la protéine EBNA1 délétée de son domaine central répété. Dans les deux cas, il apparaît que l’activité d’HMGB1 n’est pas associée à la formation d’un complexe ternaire stable (ADN/EBNA1/HMGB1), ce qui suggère que l’action d’HMGB1 est au mieux très transitoire. De plus, nous avons pu démontrer que les conditions expérimentales qui permettent d’analyser l’interaction entre EBNA1 et l’ADN sont délétères vis-à-vis de l’activité d’HMGB1. Des mesures de l’activité d’un promoteur cellulaire placé sous contrôle de l’élément FR confirment la contribution positive d’HMGB1, et d’une protéine proche, HMGB2, à l’activité transactivatrice d’EBNA1. Des expériences de colocalisation et de FRET, menées au laboratoire en utilisant des protéines fusionnées aux protéines DsRed et GFP, démontrent qu’EBNA1 et HMGB2 colocalisent partiellement et sont susceptibles d’établir des interactions spécifiques lorsque des formes d’HMGB2 de mobilité altérée sont utilisées.