Développement d'une puce à protéine pour l'analyse quantitative du protéome par spectrométrie de masse

Development of protein microarrays to quantify the proteome by mass spectrometry

• Auteur / Autrice : Nelly Papin
• Direction : Ivo Glynne Gut
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris 5
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université Paris Descartes. Faculté de médecine

Mots clés

Mots clés contrôlés

Analyse par réseau de protéines

Spectrométrie de masse MALDI

Anticorps

Protéome

Filtres à protéines

Spectrométrie de masse

Anticorps

Protéomique

Résumé

Ce projet de thèse s'inscrit dans le contexte d'extension à la fois qualitative et quantitative des domaines d'investigation post-génomiques. La protéomique en particulier a vécu ces dernières années un essor remarquable en terme de nouvelles technologies à haut débit. Ce travail vise à développer une puce à protéine permettant de quantifier de façon ciblée un grand nombre de protéines d'intérêt au sein d'échantillons complexes. Pour ce faire, les protéines issues d'échantillons différents sont discernées par un marquage chimique différentiel. Les échantillons ainsi marqués sont alors mélangés puis déposés sur une puce présentant des anticorps spécifiques de chaque protéine d'intérêt. Retenues spécifiquement sur la puce à anticorps, les protéines peuvent ensuite être analysées de façon quantitative par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Afin de démontrer la faisabilité de cette technologie, a été développée la quantification par MALDI-TOF basée sur une modification chimique différentielle et étudié son impact sur l'intéraction anticorps. Les agents de capture ont été sélectionnés et caractérisés parmi les anticorps commerciaux les plus adéquats à l'étude des protéines du sérum. Ceci afin de rendre ces techniques facilement applicables aux besoins diagnostics et cliniques. Nous avons ainsi réalisé la quantification de l'apolipoprotéine AI au sein du sérum en corrélation avec les analyses diagnostics.

This thesis project deals with protein quantification and characterization technology. The aim of this thesis was to develop a protein microarray to quantify proteins in different biological samples. The method involved differential labelling of proteome extracts with chemical tags for the purpose of protein differenciation and quantification. After modification, the protein samples were mixed and applied to a hydrogel antibody microarray. Following washing with PBST, the captured proteins were digested by trypsin or glu C on the features. The peptides were then analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry to obtain their relative quantification. As a proof of concept, was developed the MS quantification based on differential chemical modification and studied the impact of modification on the antibody interaction. Capture agents were commercial available antibodies which had suitable binding characteristics. Using this approach, we achieved quantification of apolipoprotein AI in serum corresponding to classical diagnostic analysis results, thus supporting our goal of applying this technology for diagnostic and clinical analysis.