Thèse soutenue

Etude et comparaison de la glycosylation de protéines natives et hétérologues : relations structure des oligosaccharides/propriétés enzymatiques

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Auteur / Autrice : Isabelle Mobeche
Direction : Guy Moulin
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
Date : Soutenance en 2007
Etablissement(s) : Montpellier 2

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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Les glycoprotéines représentent la moitié des protéines eucaryotes. Elles possèdent des oligosaccharides N- et/ou O-liés, très hétérogènes en terme de structure et de composition et représentant de 1 à 80% de la masse de la glycoprotéine. Les rôles des oligosaccharides sont multiples : modulation des propriétés physico-chimiques de la protéine, influence sur sa stabilité, phénomène de reconnaissance… Ils sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires et certaines structures sont immunogènes. Le type de glycosylation est fonction de l’hôte producteur peut être un facteur limitant au développement de certains systèmes d’expression hétérologues, notamment pour la production des protéines thérapeutiques. Notre système d’étude est basé sur 2 glycoprotéines modèles: la phytase de D. Castellii CBS 2923 et la b-glucosidase de C. Molischiana 35M5N. Afin d’évaluer l’importance de la nature de l’hôte et de celle de la protéine sur la glycosylation observée, ces 2 protéines ont été exprimées dans 2 hôtes hétérologues : P. Pastoris et S. Pombe. Le clonage des gènes, la production et la purification des enzymes natives et recombinantes ont été réalisés. La glycosylation (pourcentage, composition, structure, occupation des sites potentiels de N-glycosylation) a ensuite été étudiée pour chacune des glycoprotéines et dans chacun des hôtes par électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse. Par ailleurs les propriétés biochimiques et catalytiques des enzymes natives et recombinantes ont été mises en relation avec les différences de glycosylation observées. La thermostabilité est la propriété la plus visiblement modifiée entre les enzymes. Les enzymes produites par S. Pombe sont en général plus thermostables et les enzymes glycosylées sont plus thermostables que leur contrepartie déglycosylée. La glycosylation réalisées par les 2 souches de levures non encore étudiées à ce jour, D. Castellii et C. Molischiana, est proche de celle réalisée par P. Pastoris. Les N-oligosaccharides sont de type interne et principalement maturés par l’ajout de mannoses liés en a-1,2. La glycosylation réalisée par S. Pombe est singulière puisqu’elle produit des galactomannanes plus longs que les oligomannoses observés dans les autres cas. La maturation des oligosaccharides est réalisée principalement par l’ajout de galactose avec des liaisons variées (a-1,2 ; a-1,3 et b-1,3). La présence de galactose et/ou celle d’acide pyruvique explique la plus grande thermostabilité observée pour les protéines produites par cet hôte. La b-glucosidase produite par C. Molischiana est sans doute hyperglycosylée et possède beaucoup de sucres liés de façon non covalente (glucose en particulier). La O-glycosylation est envisageable dans tous les cas et la présence d’O-oligomannosides a été mise en évidence par spectrométrie de masse pour les phytases produites par D. Castellii et P. Pastoris