Vectorisation de siRNas dans le cerveau de la souris : application à l'étude du rôle des hormones thyroïdiennes

• Auteur / Autrice : Zahra Hassani
• Direction : Barbara Demeneix
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris, Muséum national d'histoire naturelle
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris ; 1995-....)
• Jury : Président / Présidente : Pascale Debey
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michela Platerotti, Bernard Zalc
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Annick Harel-Bellan, Alain Chédotal

Mots clés

Mots clés contrôlés

Neurologie expérimentale

Souris transgéniques

Expériences

Souris

Neurogénétique

Cellules souches neurales

Résumé

Une meilleure connaissance des cellules souches neurales (CSN) constitue un enjeu thérapeutique majeur pour le traitement des maladies neurodégénératives ou de maladies congénitales affectant le système nerveux central. Aujourd’hui, la biologie fondamentale des cellules souches est très largement étudiée. L’un des moyens possibles pour étudier la fonction d’un gène dans un contexte physiologique donné est l’utilisation de l’ARN interférence (ARNi). Nous avons mis au point différentes méthodes pour véhiculer des petits ARNs interférents (siRNAs) dans les zones neurogéniques de souriceaux et de souris adultes. Nous montrons que dans le cerveau de souriceaux l’utilisation de lipides cationiques combinés à des lipides neutres (JetSI/DOPE) constitue le moyen le plus efficace de délivrer des siRNAs. En revanche chez l’adulte, l’injection de plasmides codant pour des petits ARNs en épingle à cheveux (shRNAs) à l’aide de polyethylenimine de 22 kDa s’est montrée plus efficace. Les hormones thyroïdiennes (HT) jouent un rôle majeur dans la neurogenèse et les étapes terminales de la formation du cerveau de mammifère. Récemment il a été montré qu’elles sont impliquées dans le potentiel prolifératif des cellules souches neurales adultes. Nous avons utilisé les outils de transfert de siRNAs mis au point dans la première partie de ce travail pour identifier des gènes cibles potentiels relayant les effets des HT sur la prolifération des CSN. Deux gènes candidats ont été étudiés : la Cycline D1, qui est un gène cible connu des HT, et Sox2, qui est un marqueur de cellules souches indispensable au cours de l’embryogenèse et de la neurogenèse. Nous montrons tout d’abord que l’inhibition du récepteur aux hormones thyroïdiennes alpha 1 (TR1) active de façon dose-dépendante l’expression d’un gène rapporteur Cycline D1-luciférase co-transfecté dans les ventricules latéraux de souriceaux. Nous montrons également par immunomarquage que les cellules Sox2-positives n’ont pas la même identité chez le nouveau-né et chez l’adulte, puisqu’elles expriment des niveaux différents en récepteurs aux HT. Enfin, des expériences de transfert de gènes somatique nous ont permis d’observer une activation de la transcription d’une région régulatrice de Sox2 en présence de T3. La poursuite de ce travail est en cours. Par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (QPCR) et immunoprécipitation de chromatine (ChIP) in vivo chez des animaux sauvages ainsi que chez des animaux transgéniques TRa°/° nous chercherons à déterminer si les régulations de la Cycline D1 et de Sox2 observées en présence d’HT sont des effets directs ou indirects.

A better understanding of the biology of neural stem cells is needed for progress to made on their use in neurodegenerative diseases. Much research is currently directed to identifying key genes implicated in neural stem cell renewal and maintenance. One means of defining the function of a gene in a given physiogical process is to use a small interference RNA (siRNA) approach to knock-down its expression in a defined cell population. With this aim in mind we chose to optimise different methods to deliver siRNA in the neurogenic zones of newborn and adult mice. We show that in the newborn mouse brain the most efficient delivery method is a combination of cationic and neutral lipids (JETsi/DOPE) wherease in the adult brain delivery is optimised by using a cationic lipid (22kD linear Polyethylenimine) to complex plasmids encoding small hairpinRNA (shRNA). In the latter case we show that a hybrid CMV-H1 promoter is more efficient than either a CMV or H1 promoter used alone. Thyroid hormones have been long known to be required for post-embryonic brain development and more recently have been shown to be required for the full proliferative capacity of the adult neural stem cell niche. We used the siRNA delivery methods optimised in the first part of the work to investigate potential target genes relaying the effects of thryoid hormone on neural stem cycling. Two candidate genes where investigated, cyclin D1, a known thyroid hormone responsive gene, and sox2, which is required for normal embryogenesis and neurogenesis and is a neural stem cell marker. First, we show that the introduction of siRNA against the alpha thyroid hormone receptor (TR1) activates, in a dose-dependent manner, transcription from the cyclin D1 promoter cotransfected into the neurogenic zone of newborn mice, demonstrating that this gene is indeed a target of thyroid hormone in this context. Second, using various combinations of antibodies we show that Sox2 and TR1 are colocalised in the neurogenic zones of both newborn and adult mice. Moreover, in vivo gene transfer experiments show that Sox2 transcription is regulated by thyroid hormone. Current work is directed to examining, with real time PCR and with chromatin immunopreciipitation in vivo, the effect of thyroid status on the regulation of the endogenous genes, Sox 2 and Cyclin D1 in both wild type mice and mice that lack all TR isoforms ( TRo/o).