Analyse par spectrométrie de masse de l'oxygène moléculaire singulet et de protéines potentiellement ciblées au sein de cellules tumorales lors de la thérapie photodynamique

Analyzez by mass spectrometry of molecular singlet oxygen and proteins potentially targeted in tumor cells during photodynamic therapy

• Auteur / Autrice : Marc Dodeller
• Direction : Jean-François Muller
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Metz

Mots clés

Mots clés contrôlés

Photochimiothérapie

Oxygène singulet

Mots clés libres

Thérapie photodynamique

Oxygène singulet

Résumé

La thérapie photodynamique (PDT) repose sur l'utilisation d'une molécule photoactive telle que le Foscan® (m-THPC). Ce médicament de seconde génération combiné à la lumière et à l'oxygène, induit la mort cellulaire soit par nécrose soit par apoptose. La première étape de nos études consiste à détecter par MALDI-TOF/MS, dans des cellules HT29 intactes (acénocarcinome du colon humain), l'oxygène singulet produit par le Foscan® (Biolitec Pharma Ldt, Dublin, Irlande) ainsi que la distribution des protéines des cellules après PDT. Le MALDI-TOF/MS a été utilisé pour mettre en évidence l'ortho-benzoylbenzène(o-BB) produit de réaction entre l'oxygène singulet généré par le Foscan® pendant le traitement PDT et le 1. 3-diphenylisobenzofurane (1,3-DPBF, sonde spécifique de l'oxygène singulet). Cette technique permet non seulement le suivi du comportement du photosensibilisateur in situ mais également la détection directe de l'oxygène singulet dans les cellules HT29 intactes. La seconde partie de nos travaux aborde le stress oxydatif induit au niveau des cellules HT29 après PDT. Pour ce faire, nous avons eu recours au gel 2D SDS-PAGE afin d'accéder à la distribution de protéines des HT29, une approche protéomique a ensuite été effectuée par spectrométrie de masse de MALDI-FT-ICR (9. 4 T, Ion Spec Varian, Californie, USA). Grâce au logiciel Imagemaster 2D platinium, la visualisation de la sous expression de quelques protéines a été possible. L'empreinte protéique spécifique de ces protéines fut caractérisée par MALDI-FT-ICR/MS) et les premiers résultats indiqueraient que les protéines de la famille des disulfides isomérases seraient sollicitées lors des processus de PDT.

Photodynamic therapy (PDT), uses a photosensitizing molecule such as 5,10,15,20-tetrakis(m-hydroxyphenyl) chlorin (m-THPC, Foscan®), a second generation drug which is specially targeted tumoural tissue with a good selectivity, light and oxygen, inducing cell death by necrosis or apoptosis. Firstly, our studies consist to detect by MALDI-TOF/MS, in intact HT29 cells (adenocarcinoma human colon), singlet oxygen generated by Foscan® (Biolitec Pharma Ldt, Dublin, Irlande) and the protein cells distribution after PDT treatment. A MALDI-TOF mass spectrometer was used to highlight ortho-benzoïbenzene (o-BB) resulting from the reaction between singlet oxygen generated by Foscan® during PDT treatment and 1,3-diphenylisobenzofurane (1,3-DPBF, a specific singlet oxygen quencher). This technique allows the following of the in situ behaviour of the photosensitizer and to detect the presence of singlet oxygen directly in intact HT29 cells. We have also studied the oxidative stress induced by PDT treatment on HT29 cells. After 2D gel SDS-PAGE step in order to observe the protein distribution, proteomic approach is carried out by MALDI-FTICR mass spectrometry (9,4 T, Ion Spec Varian, California). Thnaks to ImageMaster 2D platinium software, we are able to visualize under expression of some proteins. The proteinic finger printings is then characterized by MALDI-FT-ICR/MS and the first results indicate that proteins of dislfide Isomerase family should be implied in PDT processes. MALDI-TOF/MS and MALDI-FTICRMS (9,4 T) appear to be a sensitive and reliable analytical tool (add to UV/Visible anf fluorescence spectroscopy) for the mechanism of PDT understanding