La résistance des virus herpes simplex à l’aciclovir : étude de l’implication des mutations localisées sur le gène de la thymidine kinase en vue de la détection de la résistance par génotypage

Herpes simplex virus resistance to acyclovir : a site-directed mutagenesis study of thymidine kinase gene mutations and detection of acyclovir-resistant HSV-1 by genotyping

• Auteur / Autrice : Émilie Frobert
• Direction : Florence Morfin-Sherpa
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Lyon 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutagénèse dirigée

Thymidine kinase

Aciclovir

Résistance aux médicaments

Herpès

Résumé

Herpes simplex virus (HSV) resistance to acyclovir (ACV) can be due to mutations occuring either in one or two genes implicated in mechanism of action of the drug, the thymidine kinase gene (TK, 95% of the cases) or the DNA polymerase gene. TK gene reveals a high degree of polymorphism and distinction between mutations related to ACV resistance or to TK polymorphism can be difficult. The study developed herein allows this distinction by using a site-directed mutagenesis method, a protein production by a reticulocytes lysat and an enzymatic test of the mutated proteins. This development of the data base of the TK mutations related to ACV resistance is necessary to genotypic test. Herein, we present a rapid PCR-based assay, performed directly on clinical samples, based on the amplification of the entire TK gene followed by PCR products sequencing. It is the first time that a genotyping assay is described to detect HSV resistance to ACV without virus culture. With this technique, we should be able to detect HSV resistance to ACV up to 90% of the cases in 24 hours

La résistance des virus herpes simplex (HSV) à l'aciclovir (ACV) repose sur la survenue de mutations localisées sur l'un des deux gènes impliqués dans le mécanisme d'action de l'antiviral, celui de la thymidine kinase (TK, responsable de 95% des cas de résistance) ou de l'ADN polymérase. Le gène de la TK possédant un polymorphisme important, il est souvent difficile de distinguer les mutations à l'origine de la résistance à l'ACV de celles correspondant au polymorphisme du gène. Notre étude associant la mutagénèse dirigée, une production des protéines mutées par un système de réticulocytes et une étude enzymatique des protéines produites permet de faire cette distinction. L’établissement de cette base de données répertoriant l’ensemble des mutations à l’origine d’une résistance à l’ACV représente un pré-requis indispensable au développement du génotypage. Le génotypage que nous avons développé repose sur l’amplification par PCR du gène de la TK suivie du séquençage des produits de PCR. C’est la première fois qu’une technique de génotypage est décrite afin de détecter la résistance des virus HSV à l’ACV directement à partir des produits pathologiques. Par cette technique, nous sommes en mesure de rendre des résultats de sensibilité ou de résistance jusqu’à 90% des cas et ceci en 24 heures