Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation : applications au tri cellulaire dans le domaine de l’oncologie

Sedimentation Field Flow Fractionation : application for cell sorting in the filed of oncology

• Auteur / Autrice : Gaëlle Begaud
• Direction : Philippe Cardot, Serge Battu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie. Chimie analytique et biologie cellulaire
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Limoges
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Limoges. Faculté de médecine et de pharmacie

Mots clés

Mots clés contrôlés

Amidons

Neuroblastome

Ostéosarcome

Phénotype

Apoptose

Neurologie

Cancérologie

Résumé

L’utilisation de la technique de Fractionnement par couplage Flux Force de Sédimentation (SdFFF) dans le domaine de l’oncologie et particulièrement de la neuro-oncologie s’inscrit dans l’étude de la dynamique de populations complexes (ostéosarcome, neuroblastome) et des phénomènes de différenciation et d’apoptose. Ces applications reposent sur le concept novateur de "cellulomique" basé sur le couplage de l'efficacité du tri cellulaire par SdFFF et de la caractérisation des propriétés biologiques de sous-populations d’intérêt. Une première approche de la SdFFF concernant le suivi de phénomènes biologiques a été menée sur les amidons. Leur dégradation enzymatique par des amylases représente l'une des plus importantes réactions mises en œuvre dans l'industrie agroalimentaire. Les travaux réalisés sur l'amidon de riz et de blé ont montré une corrélation entre la cinétique de dégradation et l'évolution des profils d'élution de l'amidon (fractogrammes). La collection de fraction a également permis d’établir une corrélation entre la variation des propriétés biophysiques des particules éluées (taille, densité) et le mécanisme de réactions enzymatiques. Ainsi après cette étape de calibration, la SdFFF apparaît comme un outil permettant, par le simple enregistrement des fractogrammes, le suivi de réactions biologiques telle que l’induction de l’apoptose des cellules cancéreuses 1547 (ostéosarcome humain) traitées par un agent apoptotique d’origine végétale, la diosgénine. La SdFFF a également permis l’isolement de cellules pré-apoptotiques. Ce tri cellulaire, rapide (quelques minutes), sans marquage et de grande sélectivité améliore ainsi la spécificité et la sensibilité des tests biologiques utilisés pour l’étude des mécanismes impliqués au cours de l’apoptose. Après le suivi d’évènements biologiques, le tri de sous-populations d’intérêt, le troisième point d’application de la SdFFF en oncologie a consisté à l’exploration de l’écologie de la population cellulaire IMR-32 (neuroblastome humain). Deux phénotypes de cellules neuroblastiques ont été isolés et ont permis la compréhension de la cinétique de différenciation et de la relation qui existe entre les cellules neuroblastiques immatures et les cellules fibroblastiques différenciées au sein de cette lignée. Enfin ces phénotypes isolés ont servi de modèles d’étude pour tester les effets d’agents apoptotique, la diosgénine et différenciant, la rosiglitazone dans le but de trouver des stratégies thérapeutiques efficaces sur ces cancers fortement résistants aux thérapies actuelles.

The use of the Sedimentation Field Flow Fractionation (SdFFF) technology in the field of oncology, and particularly in the neuro-oncology registers, is now implicated in the study of the dynamics of complex populations (osteosarcoma, neuroblastoma) and differentiation or apoptosis phenomena. These studies lie on the new concept of “cellulomic” based on the hyphenation of SdFFF cell sorting and the biological characterization of interesting sub-populations. The first approach of SdFFF was performed with the monitoring of biological events in starch populations. Enzymatic starch granule amylosis is one of the most important reactions in food and pharmaceutical industrial processes. Studies on wheat and rice starches demonstrated a correlation between fractogram changes and enzymatic hydrolysis. These results showed the interest in coupling SdFFF sub-population sorting with particle size measurement methods to study starch size/density modifications associated to hydrolysis. After this first step of calibration, SdFFF proved to be a fast, practical and specific method to monitor biological events. This was extend to the study of diosgenin (plant steroid) induced apoptosis of 1547 osteosarcoma cells. Moreover, SdFFF was used, for the first time, to perform the isolation of pre-apoptotic cells. This pre-apoptotic sub-population which is in an early stage of apoptosis could be used as cellular model for the study of diosgenin induced apoptotic kinetics. This fast, tagless and very selective method also increases specificity and sensibility of biological tests used to study apoptotic mechanisms. After the monitoring of biological events, the sorting of specific sub-populations of interest, the third SdFFF application in oncology consisted in the study of the ecology or the phenotypical relationship in the complex IMR-32 cell line, used as a model of neuroblastoma. These cell lines have a great clinical and biological heterogeneity which affects response to treatmant and patient outcome. For the first time, two phenotypes of neuroblastic, N-type, cells have been sorted by SdFFF, and allowed the understanding of differentiation kinetics and the relationship which exists between N-type and differentiated, S-type, cells. Finally, these isolated phenotypes were used as cellular models to test specific responses to apoptotic inducers, Fas ligand or diosgenin and differentiating inducers, retinoic acid or rosiglitazone in order to find new effective therapeutic strategies for these tumors actually resistant to chemotherapies.