Recherche Avancée

Thèse soutenue

Infection à coxsackievirus B4 dépendante d'anticorps et diabète de type 1

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Auteur / Autrice : Pierre Sauter
Direction : Didier Hober
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Virologie
Date : Soutenance en 2008
Etablissement(s) : Lille 2

Résumé

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Les coxsackievirus B (CVB) appartiennent à la famille des picornaviridae, de petits virus à ARN non enveloppés dont la capside est composée de 60 protomères qui sont chacun constitués par quatre protéines structurales : les protéines VP1, VP2 et VP3 qui sont exposées à la surface de la capside, et la protéine VP4 qui est située à l'intérieur de la capside en contact avec le génome. Ces virus, en particulier CVB4 sont impliqués dans la pathogenèse du diabète de type 1. Lors de travaux antérieurs réalisés par notre équipe, nous avons décrit l'infection dépendante d'anticorps des cellules mononuclées du sang périphérique par CVB4. Il a été montré que CVB4 infecte les cellules mononuclées du sang périphérique (CMN) lorsqu'il est incubé en présence de plasma avant d'infecter ces cellules, cette infection étant accompagnée de la synthèse d'IFN-alpha par ces cellules. Il a également été montré par notre équipe que la cible des anticorps accroissant la synthèse d'IFN-alpha des CMN viro-induite par CVB4E2 est la protéine de capside VP4 et que les anticorps anti-VP4 étaient détectés plus fréquemment et en plus grande quantité dans le plasma des patients diabétiques que chez les sujets sains. Le phénomène d'ADE est décrit dans les infections virales in vitro et même pour certains virus in vivo dans des modèles animaux mais il a été peu décrit pour les virus du genre enterovirus. L'objectif de cette thèse est d'améliorer notre connaissance de l'infection dépendante d'anticorps des CMN par CVB4E2 : montrer que la protéine VP4 est la cible des anticorps accroissant l'infection des CMN par CVB4E2 et identifier la zone de VP4 reconnue par les anticorps. L'infection productive des CMN par CVB4E2 a été évaluée à l'aide d'une PCR quantitative en temps réel amplifiant l'ADN complémentaire obtenu par rétrotranscription de l'ARN négatif intracellulaire de CVB4E2. La production d'IFNalpha par les CMN a été évaluée en déterminant les concentrations de cette cytokine dans le surnageant de culture à l'aide d'une méthode immunologique (DELFIA). Afin de déterminer le rôle de la protéine de capside VP4 dans l'infection dépendante d'anticorps des CMN par CVB4E2, nous avons exprimé les protéines de fusion MBPVP4 et MBP dans les bactéries Escherichia coli K12 TB1. A l'aide de ces protéines, nous avons montré que la protéine de capside VP4 est la cible des anticorps accroissant l'infection dépendante d'anticorps des CMN. En effet MBPVP4 et non MBP inhibe la production d'IFNalpha des CMN viro-induite par CVB4E2 dépendante du plasma dans des expériences de compétition entre ces protéines et CVB4E2. De plus des anticorps contenus dans le plasma humain ont été élués à partir de plaques coatées avec les protéines MPBVP4 et MBP. La préincubation avec CVB4E2 de plasma, ou d'anticorps anti-MBPVP4 élués mais non d'anticorps anti-MBP accroît l'infection des CMN, qui est associée à une stimulation de la production d'IFNalpha. Nous avons montré que la zone de la protéine VP4 de CVB4E2 reconnue par les anticorps accroissant la production viro-induite d'IFN-alpha par les CMN se trouve entre les acides aminés 10 à 30. En effet, des expériences de compétition ont été effectuées entre CVB4E2 et des peptides chevauchant couvrant l'intégralité de la séquence de la protéine VP4, vis-à-vis de plasma contenant des anticorps accroissant la production viro-induite d'IFN-alpha par les CMN. Seul le peptide couvrant les acides aminés 10 à 30 de la protéine VP4 de CVB4E2 (VP411-30) entre en compétition dans notre système. De plus, la moyenne des valeurs index des anticorps dirigés contre le peptide VP411-30 et des anticorps dirigés contre la protéine VP4 (native ou recombinante) de CVB4E2 contenus dans les plasmas des sujets sont similaires. Les proportions de plasmas de patients diabétiques de type 1 positifs pour les anticorps dirigés contre le peptide VP411-30 et positifs pour les anticorps dirigés contre la protéine VP4 (native ou recombinante) de CVB4E2 sont similaires. Les valeur index individuelles des anticorps dirigés contre le peptide VP411-30 et celles des anticorps dirigés contre la protéine VP4 (native ou recombinante) de CVB4E2 sont significativement corrélées. Les valeurs index moyennes des anticorps dirigés contre le peptide VP411-30 et des anticorps dirigés contre la protéine VP4 (native ou recombinante) de CVB4E2 sont significativement plus élevées chez les patients diabétiques que chez les sujets sains et la proportion de plasma positifs pour les anticorps dirigés contre le peptide VP411-30 ou contre la protéine VP4 (Native ou recombinante) de CVB4E2 est significativement plus importante chez les patients diabétiques de type 1 que chez les sujets sains. La détection d'anticorps dirigés contre le peptide VP411-30 contenus dans le plasma des patients avec un diabète de type 1 et les valeurs obtenues n'étaient pas associées à des allèles HLA-DR associés à un risque accru de développer la maladie. La fixation d'anticorps à CVB4E2 via la protéine de capside VP4 suppose qu'au moins une partie de cette protéine est accessible aux anticorps. Nous avons étudié la structure de cette protéine : nous avons d'abord séquencé la région de l'ARN génomique de CVB4E2 correspondant à cette protéine en amplifiant l'ADN complémentaire obtenu par rétrotranscription de cette région du génome viral, ensuite nous avons déterminé la séquence de ces amplifiats par une méthode semi-automatique. La séquence nucléotidique ainsi connue a permis de déduire la séquence d'acides aminés de la protéine VP4, ce qui a rendu possible la modélisation de cette protéine à l'aide du serveur Swiss model. Il en découle que la zone de VP4 correspondant au peptide VP411-30 est probablement une séquence d'acides aminés sans structure secondaire liée à un feuillet beta. Cette séquence est accessible aux anticorps anti-VP4, ce qui implique une exposition permanente ou transitoire de cette protéine à l'extérieur de la capside à 37°C. Au total, nos travaux ont permis d'améliorer la connaissance des mécanismes moléculaires de l'infection dépendante d'anticorps des CMN par CVB4E2. Nous avons mis en évidence le rôle de VP4 et des anticorps anti-VP4 dans l'infection à CVB4E2 des CMN et nous avons montré le rôle de la séquence d'acides aminés 11 à 30 de VP4 dans l'accroissement dépendant du plasma de la production viro-induite d'IFN-alpha par CMN. Nos résultats suggèrent que la séquence d'acides aminés 11 à 30 de la protéine VP4 de CVB4E2 peut être utile pour la détection d'anticorps anti-VP4 présents dans le sang des individus et notamment dans le sang des patients avec un diabète de type 1. Nos travaux apportent également des informations concernant la structure de CVB4E2, ils montrent que la protéine VP4 est en partie externalisée à température physiologique (37°C) et n'est pas entièrement contenue à l'intérieur de la capside au contact du génome viral contrairement aux données obtenues par cristallographie aux rayons X avec le poliovirus et CVB3.