Thèse soutenue

Développement d’un modèle prédictif de l’énantiosélectivité des lipases
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Auteur / Autrice : Sophie Guenot
Direction : Magali Remaud
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Microbiologie et biocatalyse industrielle
Date : Soutenance en 2007
Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Résumé

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L’étude a porté sur le développement d’un modèle prédictif de l’énantiopréférence de la lipase de Burkholderia cepacia ATCC 21808 et plus particulièrement sur la relation pouvant exister entre l’accessibilité au site actif des énantiomères dérivés du (R,S)-alpha-bromo-phényl acétate d’éthyle et l’énantiosélectivité. Une approche mixte, couplant des techniques de modélisation moléculaire classiques à de nouvelles techniques algorithmiques de planification de mouvements issues de la robotique, a été utilisée pour modéliser les trajectoires de différents esters dérivés de l’alpha-bromo-phényl acétate d’éthyle. Les résultats obtenus in silico ont montré que les recherches de trajectoires sont plus rapides avec l’énantiomère (R) qu’avec l’énantiomère (S) pour 7 substrats synthétisés par voie chimique. De manière qualitative, ces résultats corrèlent avec l’énantiosélectivité de l’enzyme, obtenue expérimentalement, indiquant que celle-ci pourrait être associée à une plus ou moins grande difficulté d’accès. De plus, l’analyse des trajectoires a permis d’identifier des cibles privilégiées de mutagénèse (points de collision fréquemment rencontrés pour tous les substrats) parmi lesquels trois positions ont été retenues : Leu-17, Val-266 et Leu-287. Afin de générer et caractériser ces mutants ponctuels, un système d’expression recombinante de la lipase de B. Cepacia chez E. Coli et un protocole de purification par chromatographie d’affinité ont été développés. Les gènes lip et hp codant respectivement pour la lipase et sa protéine chaperonne ont été clonés dans différents vecteurs d’expression sous le contrôle de différents promoteurs. Le plus haut niveau d’activité lipase sous forme soluble jamais décrit dans la littérature concernant cette enzyme a été obtenu en utilisant le vecteur pFLAG-ATS sous le contrôle du promoteur tac (6679 U/Lculture). Les mutants ponctuels ont été construits par mutagénèse dirigée en remplaçant chaque position par les 19 autres acides aminés possibles. Les mutants V266, présentant les plus hautes activités lipase lors d’un crible au para-nitrophényl butyrate, ont été sélectionnés dans un premier temps afin de mesurer leurs énantiosélectivités lors de l’hydrolyse de l’α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle. Parmi ces mutants, le V266G, présente une inversion d’énantiosélectivité en faveur de l’énantiomère (S) (E=18). L’absence de chaîne latérale de la glycine diminue l’encombrement stérique au niveau de la position 266 permettant ainsi à l’énantiomère (S) soit d’accéder plus facilement au site catalytique, soit de mieux se positionner pour former l’intermédiaire tétraédrique. En parallèle, un protocole de production de la lipase de B. Cepacia à l’échelle microplaque a été développé et validé sur la banque de mutants V266, afin de disposer, à terme, d’un outil de criblage pour de plus larges banques de mutants créées par évolution dirigée