Evolution dirigée de l'amylosaccharase par la technique MutaGen™ pour l'obtention de variants thermostables

• Auteur / Autrice : Stéphane Emond
• Direction : Pierre Monsan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Mots clés

Mots clés contrôlés

Criblage pharmacologique

Technologie des protéines

Protéines -- Dénaturation (chimie)

Enzymes

ADN polymérases

Mutagenèse

Saccharose

Amylose

Mots clés libres

Amylosaccharase

évolution dirigée

Mutagénèse aléatoire

ADN polymérases infidèles

Thermostabilité

Solvants organiques

Polymère

Amylose

Résumé

L'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (AS) est une transglucosidase qui utilise le saccharose comme donneurs d'unités glucosyle pour synthétiser un polymère de type amylose et glucosyler efficacement des accepteurs comme le glycogène. Ce biocatalyseur est un outil industriel prometteur par sa capacité remarquable à utiliser un substrat abondant et peu coûteux (le saccharose) pour la synthèse de polymères ou de glucoconjugués d'intérêt. L'AS est cependant une enzyme peu adaptée aux contraintes industrielles du fait de son faible niveau d'activité (kcat = 1 mol/s), sa thermostabilité médiocre (Temps de demi-vie (30°C) = 21 h) et sa résistance limitée aux solvants organiques. Pour améliorer ces propriétés, une approche d'ingénierie combinatoire (ou évolution dirigée) reposant sur l’utilisation de la technique de mutagénèse aléatoire MutaGen brevetée par la société Millegen a été appliquée à l’AS. Dans un premier temps, trois banques de variants comportant plus de 105 clones ont été construites par réplication infidèle catalysée par les polymérases mutagènes d’origine humaine, pol beta et pol eta. L’analyse des séquences d’un échantillon représentatif montre que la diversité accessible par cette méthode (taux et types de mutation) dépend de la polymérase employée, ce qui démontre l’intérêt et la souplesse de cette nouvelle approche. Un protocole d’isolement de variants thermostables ou résistants au DMSO comprenant une première étape de sélection in vivo sur milieu solide suivi d’un criblage automatisé au format microplaque a ensuite été optimisé. Le coefficient de variance du procédé a été réduit de 27 à 12. 5%, ce qui permet de minimiser le taux de faux positifs. Appliqué au criblage de plus de 7000 variants actifs, le protocole développé a permis d’identifier 3 variants présentant une augmentation d’un facteur 3. 5 à 10 de la thermostabilité à 50 °C. Les modèles des variants thermostables ont été construits. Dans le cas du meilleur variant (R20C/A451T), l’analyse structurale indique que l’augmentation de thermostabilité est liée à la réorganisation du pont salin impliquant R20 et la création d’une liaison hydrogène médiée par T451. Ce variant est la seule amylosaccharase active à 50°C, capable de produire des chaînes d’amylose de degré de polymérisation moyen de 52 avec un rendement 3 fois plus élevé que celui observé pour l’enzyme sauvage à 30°C

Amylosucrase from Neisseria polysaccharea (AS) is a transglucosidase that uses sucrose as glucosyl unit donor to synthesize an amylose-type polymer and to glucosylate efficiently acceptor molecules like glycogen. Due to its ability to use sucrose which is a cheap and readily available substrate, AS is a promising industrial biocatalyst for the synthesis of amylose polymers or glucoconjugates of interest. However, the development of industrial processes involving AS is limited by its low catalytic efficiency on sucrose alone (turn-over = 1 mol/s), its thermostability (Half-life (50°C) = 3 min) and its weak resistance to organic solvents. A directed evolution approach using MutaGen, a new random mutagenesis method patented by MilleGen (Labège-Innopole, France), was applied to improve the properties of AS. First, three AS variant libraries were constructed by replicating the DNA sequence encoding wildtype AS with mutagenic human polymerases pol beta and pol eta. The sequence analysis of randomly chosen clones showed that the error rate and the kind of mutations generated can be monitored following the polymerases employed. A process enabling the identification of variants displaying higher thermostability or increased resistance toward DMSO was then optimized. It consists of two successive steps: (i) an in vivo selection which eliminates inactive variants followed by (ii) automated screening of active variants to isolate mutants displaying enhanced features. The coefficient of variance of the screening process was decreased from 27% to 12. 5%, minimizing false positive rate. Around 7,000 active AS variants were screened for increased thermostability using this procedure. These experiments led to the identification of three improved variants (two double mutants and one single mutant) showing 3. 5 to 10-fold increased half-lives at 50°C compared to the wild-type enzyme. In silico comparative analysis between the wild-type AS structure and the modeled variants allowed to highlight molecular features implicated in thermostability enhancement. In the case of the most thermostable variant isolated (R20C/A451T), the observed enhancement could be the result of a reorganization of salt bridges in the vicinity of C20 and the introduction of a hydrogen bond between Thr451 and Asp488 in AS flexible loop 8. This double mutant is the most thermostable amylosucrase known to date. When employed at 50°C, it produces amylose chains with a mean degree of polymerization of 52 with a yield up to 3 times higher than that obtained for such amylose chain synthesis with the wild-type enzyme at 30°C