Etude du cycle de réplication de ZAM et d'Idefix, deux rétrovirus endogènes de Drosophila melanogaster : processus d'intégration et de traduction

• Auteur / Autrice : Babacar Faye
• Direction : Bernard Dastugue
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Clermont-Ferrand 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Traduction génétique

Virus -- Reproduction (biologie)

Drosophila melanogaster

Rétroviridés

Résumé

ZAM et Idefix sont 2 rétrovirus endogènes de Drosophila melanogaster, qui possèdent comme les rétrovirus de mammifères tels que HIV, 2 longues répétitions terminales (LTR) en 5' et 3' encadrant 3 cadres de lecture ouverts analogues aux gènes rétroviraux Gag, Pol et Env, et une région non traduite (5'UTR) en aval du 5'LTR. Ce travail de thèse a consisté à étudier 2 étapes essentielles dans le cycle de réplication des rétrovirus : la traduction des protéines virales et l'intégration de l'ADN proviral. La région 5'UTR d'Idefix initie la traduction des protéines virales par une entrée interne des ribosomes (IRES) et Gag réprime ce mode traduction. Cette région est structurée en 5 boucles (A, B, C, D, E) et en séquences répétées en 3'. Nous avons montré in vitro que la séquence minimale capable d'initier la traduction IRES-dépendante des protéines virales d'Idefix (IRES minimum) est contenue dans la séquence 576-834 nts de la région 5'UTR. La boucle A et les séquences répétées ne sont pas nécessaires à la fonction IRES. En outre le domaine Cter de la protéine Gag est responsable de la répression de l'IRES d'Idefix. Ce domaine contient 5 clusters d'acides aminés basiques qui seraient probablement responsable de l'interaction de Gag d'Idefix avec son ARN. Cette partie Cter de Gag se présente comme un domaine clé dans la réplication d'Idefix. Les données permettent de proposer un modèle dans lequel, au cours du cycle viral, l'ARNm d'Idefix est directement traduit par son IRES, puis la protéine Gag produite se fixe sur cet ARN, au niveau région 5'UTR par son domaine Cter et le conduit à l'encapsidation. Cette régulation entre traduction et encapsidation est fonction de la concentration de la protéine Gag. L'ARN génomique des rétrovirus est rétrotranscrit en ADNc et, est inséré dans l'ADN de l'hôte à partir duquel, il sera transcrit par la machinerie de cellulaire. ZAM s'intègre spécifiquement dans une séquence consensus GCGCGC. Nous avons montré que l'intégrase (IN) de ZAM interagit spécifiquement avec ce site d'insertion et avec un autre site de fixation dont la séquence contient au moins le triplet CTC. L'interaction de l'IN de ZAM avec ce site de fixation est nécessaire à son activité endonucléasique au niveau du site d'intégration GCGCGC. De plus, nous avons démontré que la fixation des LTR de ZAM et de l'ADN de l'hôte est la propriété du domaine Cter de l'IN. Ces données nous permettent de proposer un modèle dans lequel, l'IN de ZAM interagit avec l'ADN proviral pour former le complexe de préintégration (PIC) et, avec le site de fixation CTC pour cliver ensuite au niveau de la séquence GCGCGC de l'ADN de l'hôte, permettant enfin l'intégration du provirus ZAM. Une meilleure compréhension des mécanismes de traduction et d'intégration de ZAM et Idefix, apporteront certainement des informations importantes pour la mise au pint des molécules contre les rétrovirus comme le HIV, vu leurs similitudes structurales et fonctionnelles.

ZAM and Idefix are 2 endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster very similar to mammalian retroviruses such as HIV. Two long terminal repeat (LTR) flank 3 open reading frames Gag, Pol and Env, and an unstranslated region (5'UTR) downstream the 5'LTR. The aim of this PhD was to study 2 essentially steps in the retroviral cycle of ZAM and Idefix : their genomic integration as proviral copies, and the translation of their proteins. The ribosome fixation on an IRES (Internal ribosomal entry site) identified in the Idefix 5'UTR region allows translation of its open reading frames. However, it has been shown that the Gag product of Idefix is able to repress this IRES dependent translation. At a structural level, the RNA molecule transcribed from the 5'UTR of Idefix is composed of 5 loops (A, B, C, D and E) and a stretch of repeated sequences present at the 3' end. We demonstrated in vitro that the minimal sequence able to initiate the IRES dependent translation, the so-called minimal IRES, is localised between the 576-834 nucleotides of the 5'UTR region of Idefix. Additionally, the A loop and the repeated sequences are not necessary for the IRES function. The C-terminal region of the Gag protein is involved in the Idefix IRES repression. This domain contains 5 basic amino acid clusters which are probably important for the interaction between Gag and its RNA. From these results, we propose a model in which Idefix mRNA are translated in an IRES dependent manner during the viral cycle. When Gag is produced, it targets and binds this RNA, and leads it to viral encapsidation. This occurs by an interaction between its basic C-terminal domain and the 5'UTR RNA. In the course of retroviral replication, the genomic RNA is firstly reverse transcribed and the resulting cDNA is inserted into the host genome as a proviral copy that will initiate new rounds of replication with the help of the cellular machinery of its host. The consensus sequence GCGCGC is known to be a preferential target for ZAM integration within the Drosophila genome. We demonstrated that the ZAM integrase (IN) interacts with 2 specific sequences of the host genome : the consensus sequence GCGCGC identified as the integration site, and another site containing the CTC sequence. We demonstrated that the IN C-terminal domain binds the ZAM LTR. We propose a model whereby ZAM integrase binds its own LTR to form a preintegration complex (PIC) and then, targets a genomic CTC triplet and cuts a proximal GCGCGC site to proceed to ZAM integration. Because of their structural and functional similarities, a better understanding of ZAM and Idefix translation and integration pathways will certainly bring crucial data for the understanding of mammalian retroviral replication cycles.