Caractérisation d'une protéine à P-loop conservée, YvcJ, et étude de son implication dans la compétence chez B. Subtilis

Characterization of YvcJ, a conserved P-loop containing protein, and its implication in competence in Bacillus subtilis

• Auteur / Autrice : Jennifer Luciano
• Direction : Anne Galinier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie moléculaire et biotechnologie
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Métabolisme

Bactéries

Nucléotides

Protéines

Bacillus subtilis

Résumé

Les protéines à P-loop (boucle de fixation des nucléotides) possèdent une séquence consensus appelée motif A de Walker. Elles sont très représentées dans les organismes procaryotes et eucaryotes et sont souvent impliquées dans des processus cellulaires clés. Parmi ce type de protéines, on retrouve des NTPases et des kinases de petites molécules ou métabolites. Un grand nombre de protéines à P-loop n'ayant pas de fonction attribuée, certaines d'entre elles pourraient être impliquées dans des régulations ou des signalisations cellulaires encore inconnues. Chez Bacillus subtilis, le gène yvcJ code pour une protéine contenant un motif A de Walker extrêmement conservé et un motif B de Walker généralement retrouvé chez des NTPases. Ce gène est conservé dans plus d'une centaine de bactéries et est souvent associé à des gènes impliqués dans le transport et/ou l'utilisation des sucres. Nous avons donc entrepris la caractérisation biochimique de cette protéine ainsi que la détermination de sa fonction cellulaire. Nous avons tout d'abord montré qu'elle était capable de fixer les nucléotides (ATP et GTP), par des expériences de protéolyse ménagée et de fluorescence et qu'elle était également capable de les hydrolyser. Nous avons ensuite montré que son activité était bien due aux motifs A et B de Walker, en comparant les paramètres cinétiques de mutants de ces deux motifs à ceux de la protéine sauvage. Ensuite, des tests de phosphorylation à partir d'extraits bruts de B. Subtilis ont été effectués en présence d'ATP radioactif, et ceux-ci ont montré la présence d'une bande radioactive (~20 kDa) dépendante de l'ajout d'YvcJ. Nous avons observé que la présence de cette bande dépendait des conditions de croissance (milieu et phase de croissance). Les résultats obtenus suggèrent que le rôle physiologique de la protéine YvcJ pourrait avoir un lien avec le passage de la bactérie en phase stationnaire de croissance, c'est-à-dire lorsqu'il y a une diminution de la quantité de nutriments. Le substrat marqué est apparemment membranaire mais le cytoplasme et la membrane sont nécessaires pour obtenir ce signal dépendant d'YvcJ. Les différentes approches biochimiques employées ne nous ayant pas permis d'identifier le substrat phosphophorylé, nous avons entrepris de caractériser la fonction cellulaire d'YvcJ par une approche physiologique. Pour cela, une souche délétée pour le gène yvcJ a été construite et un criblage phénotypique a été réalisé. Nous avons alors observé que l'absence d'yvcJ entraînait une diminution de l'efficacité de transformation de B. Subtilis (facteur 50). Une analyse transcriptomique a montré que l'expression des gènes régulés par ComK, le facteur de transcription de la compétence, était réprimée dans le mutant, et que la surproduction de ComK compensait le défaut de compétence de la souche délétée pour yvcJ. Nous essayons actuellement de caractériser précisément le rôle d'yvcJ dans les différentes voies de régulation conduisant au développement de la compétence.

The phosphate binding loop (P-loop) or Walker motif A is commonly found in nucleotidebinding proteins, like NTPases and some kinases which are usually involved in essential cellular processes. The genes encoding for P-loop-containing proteins are abundantly present in prokaryote and eukaryote genomes but many of them remain of unknown function. In Bacillus subtilis, the gene yvcJ is encoding for a protein that contains a P-loop extremely conserved in N-terminal of its sequence and a Walker B motif that is mainly found in NTPases. This gene is conserved in more than one hundred bacteria and is most often associated with genes encoding for proteins involved in sugar transport and/or utilization. The objective of this thesis was to determine if YvcJ was actually a P-loop-containing protein and what is its cellular function. Firstly, we showed that YvcJ was able to bind nucleotides (ATP and GTP) and to hydrolyse them. Several site-directed mutants were generated and we showed that the enzymatic activity of YvcJ was mediated by the Walker A and B motifs. Secondly, phosphorylation assays of B. Subtilis crude extracts with radioactive ATP revealed the presence of a labelled band (~20 kDa) depending on the addition of the protein YvcJ. We observed that this phosphorylation signal was dependent on the growth conditions (medium and growth phase). All these observations suggested that physiological function of YvcJ could have a link with the adaptive responses of the end of the exponential growth phase, when nutrients become limiting. The radioactive band was mainly found in the membrane fraction but the cytoplasm and the membrane fraction were both necessary to obtain this signal. Unfortunately, due to the instability of the signal, it was not possible to isolate and identify it by traditional biochemical techniques. In order to determine its cellular function, we performed several physiological assays with an yvcJ mutant strain and showed that deletion of yvcJ results in 50-fold decreased competence ability. A transcriptomic analysis showed that expression of genes controlled by ComK, the main competence transcription regulator, was repressed in the yvcJ mutant strain. Furthermore, an overexpression of ComK suppressed the competence phenotype of the yvcJ mutant. We are now trying to identify the precise role of YvcJ in the regulatory pathways involved in competence development.