Développement et validation in vitro et in vivo d'un nouveau système inductible de la recombinase Cre par une approche de complémentation de fragments

Development and in vitro and in vivo validation of a new inducible form of Cre recombinase using a protein fragment complementation approach

• Auteur / Autrice : Nicolas Jullien
• Direction : Jean-Paul Herman
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'interactions cellulaires neuroendocriniennes (Marseille)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Souris transgéniques

Integrases

Délétion de gène

Protéines de liaison au tacrolimus

Sirolimus

Recombinaison génétique

Recombinases

Résumé

La recombinase Cre permet l’excision ou l’inversion d’une séquence génomique flanquée de deux séquences de 34 pb, nommées loxP. Cette propriété permet de générer des animaux dans lesquels l’expression ou l’inactivation d’un gène peut être contrôlée par l’expression de la recombinase. Un des défis actuels est de pouvoir contrôler finement le domaine spatio-temporel d’action de la recombinase afin d’étudier le rôle des gènes dans la fenêtre d’intérêt, en s’affranchissant notamment des effets délétères d’une recombinaison précoce. Nous avons développé une nouvelle approche de régulation de l’activité Cre basée sur un concept de complémentation inductible. Ce nouveau système, dénommé DiCre pour « Dimerizable Cre », est composé de deux fragments inactifs de Cre fusionnés aux deux protéines FRB et FKBP. Ces dernières ont la propriété d’hétérodimériser avec la rapamycine, une petite molécule liposoluble. L’apport de celle-ci dans le système conduit ainsi à l'association des deux fragments de Cre et à une restauration de l’activité. Nous avons montré que DiCre est fonctionnel in vitro dans des cellules de mammifères, et qu’il permet d’obtenir à la fois un excellent niveau de répression à l’état basal et un très fort niveau d’activation après induction par la rapamycine ou d’un analogue non toxique. Nous avons, par la suite, créé et caractérisé une lignée murine DiCre par knock-in au locus Rosa26. Malgré l’impossibilité d’induire la recombinaison au cours du développement embryonnaire, nous avons montré que de DiCre était inductible et efficace dans certains tissus adultes tout en permettant une répression parfaite, c’est à dire une absence totale de recombinaison, à l’état basal.

Cre recombinase catalyses the inversion or excision of any DNA sequence flanked by two 34 bp sequences, named loxP. This property is widely used to control the expression or inactivation of a given gene by Cre in conditional transgenesis. One of the main challenges in this area is to control precisely the spatiotemporal pattern of Cre expression to study genes in well-defined conditions and avoid the deleterious effects induced by early or ectopic recombination. We have developed a new approach to regulate Cre’s activity based upon regulatable fragment complementation. This new system, that we have called DiCre for Dimerizable Cre, is composed of two inactive moieties of Cre, fused respectively to FRB and FKBP. These two proteins form strong heterodimers upon addition of rapamycin, a small liposoluble molecule. The formation of the FRB-FKBP heterodimer brings the Cre moieties into close physical proximity and leads to the reconstitution of enzymatic activity. We have shown that DiCre is functional in cell cultures: recombinase activity is very low in absence of rapamycin, while the addition of the drug, or a non-toxic analog, leads to the rapid reinstatement of a high level activity. Transgenic mice expressing DiCre were created by insertion of DiCre into the Rosa26 locus by homologous recombination. The subsequent caracterization showed that, although no recombination could be induced during embryonic development, DiCre was quite efficient is several adult tissues, as it insured a total absence of recombination in the absence of rapamycin treatment and allowed a good level of recombination upon treatment of the animals by rapamycin.