Caractérisation du complexe Culline3-BTB chez Arabidopsis thaliana

Characterization of the Culline3-BTB complex in Arabidopsis thaliana

• Auteur / Autrice : Alexis Thomann
• Direction : Pascal Genschik
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ubiquitine

Plantes -- Embryologie

Plantes -- Ontogenèse

Génétique

Arabidopsis thaliana

Protéines -- Dénaturation (chimie)

Résumé

La protéolyse ubiquitine-dépendante est un mécanisme conservé chez les eucaryotes permettant la dégradation ciblée de nombreuses protéines. Cette réaction se fait en trois étapes successives qui font intervenir l’activité de trois types d’enzymes. Une enzyme d’activation, « ubiquitin-activating » ou E1, prend en charge l’ubiquitine libre et la transfère sur une enzyme de conjugaison, « ubiquitin-conjugating » ou E2. L’ubiquitine est ensuite liée au substrat par l’intermédiaire d’une « ubiquitin-ligase » ou E3. C’est l’enzyme E3 qui a la fonction la plus importante dans ce processus car c’est elle qui détermine la spécificité de reconnaissance de la protéine à dégrader. Il en existe de différents types que l’on peut regrouper en sept classes distinctes selon leur mode d’action et leur structure. L’une des classes est représentée par le complexe CUL3-BTB/POZ (Bric à brac, Tramtrack and Broad complex/Pox virus and Zinc finger). Le génome d’Arabidopsis thaliana possède deux gènes codant pour des homologues de la Culline 3, nommés CUL3A et CUL3B. Au cours de mon travail de thèse j’ai participé à la caractérisation fonctionnelle de cette enzyme. Ainsi nous avons montré que les deux gènes CUL3A et CUL3B sont exprimés de manière ubiquitaire. De plus, nous avons identifié 76 protéines à domaine BTB dans le génome d’Arabidopsis et montré que certaines d’entres elles interagissent avec les deux protéines CUL3A et CUL3B dans la levure. Les deux Cullines 3 d’Arabidopsis interagissent également avec la protéine Rbx1. Dans le but d’identifier la fonction du gène CUL3A nous avons utilisé une approche par génétique inverse. Nous avons ainsi pu montrer que le mutant nul de la cul3a fleurit plus tardivement que la plante contrôle et qu’il présente une sensibilité réduite à la lumière rouge lointaine. Nous avons ensuite caractérisé plus en détail, l’expression des deux gènes CUL3A et CUL3B dans le tissus et organes reproducteurs et observé qu’ils sont exprimés de manière similaires dans la fleur et au cours de l’embryogenèse. Nous avons alors analysé les conséquences pour la plante de la perte de fonction de ces deux gènes en créant un double mutant. Les résultats obtenus montrent que la perte de fonction des cullines 3 chez Arabidopsis réduit la transmission gamétophytique et cause la létalité embryonnaire avec un arrêt prédominant au stade cœur du développement de l’embryon. Au niveau cytologique ces embryons avortés présentent des aberrations du plan de formation de l’embryon et de l’endosperme. Finalement, mes travaux en cours mettent en évidence la participation des cullines 3 dans la régulation de la synthèse de l’éthylène mais aussi dans le contrôle de la transition entre le stade végétatif et le stade floral.

Ubiquitin-dependent degradation by the 26S proteasome has emerged as a central mechanism to control protein turnover in eukaryotes. Ubiquitin transfer requires the activity of E1 (ubiquitin activating), E2 (ubiquitin conjugating) and E3 (ubiquitin ligase) enzymes. Ubiquitin ligases are multiprotein complexes that specifically recognize the substrates and mediate their ubiquitin-dependent degradation. To date several classes of E3s have been reported, most of them based on a protein with cullin domain. Eukaryote genomes encode several cullins: CUL1, CUL2, CUL3, CUL4 and CUL5, which are all believed to form protein complexes with ubiquitin-ligase activity. I focused my work on one of these cullin based E3 ligase, the CUL3-BTB complex. In this report, I describe the molecular and genetic characterizations of the plant Cullin3. We found that CUL3A is ubiquitously expressed in plants and is able to interact with the ring-finger protein RBX1. Yeast two-hybrid experiments indicate that BTB-domain proteins are able to physically interact with both CUL3A and CUL3B, suggesting that Arabidopsis CUL3 forms E3 protein complexes with certain BTB proteins. In order to determine the function of CUL3A, we used a reverse genetic approach. The cul3a null mutants flowers slightly later than the control plants. Homozygous cul3b mutant plants developed normally and were fully fertile. Thus, we investigated the consequences on plant development of combined Arabidopsis cul3a cul3b loss-of-function mutations. The disruption of both the CUL3A and CUL3B genes reduced gametophytic transmission and caused embryo lethality. Arrest of embryogenesis occurred at multiple stages of embryo development, but predominantly at the heart stage. At the cytological level, CUL3 loss-of-function mutations affected both embryo pattern formation and endosperm development. In addtion, recent results show that the Culline 3 is also involved in the regulation of ethylene biosynthesis.