Etude des facteurs impliqués dans la dégradation des ARNm chez la levure saccharomyces cerevisiae par fusion de domaines fonctionnels et études in vitro

• Auteur / Autrice : Anne-Laure Finoux
• Direction : Bertrand Séraphin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Génétique
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Saccharomyces cerevisiae

ARN messagers

Résumé

Au cours de cette thèse, j’ai entrepris différents projets ayant pour objectif une meilleure compréhension des mécanismes de dégradation des ARNm eucaryotes ches Saccharomyces cereviseae. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la régulation de la déadénylation qui représente l’étape limitante des deux voies majeures de dégradation. Nous avons construit un outil permettant de cibler des protéines sur des ARNm rapporteurs. Grâce à ce système, nous avons pu démontrer que le recrutement du complexe Pop/Crr4 était suffisant pour induire une dégradation du messager ciblé. L’activation est spécifique du complexe de déadénylation puisque le ciblage d’autres facteurs protéiques n’affecte pas la demi-vie de l’ARNm. L’analyse fine de la dégradation du messager nous a permis d’identifier de nouveaux intermédiaires de dégradation générés par une digestion 3’-5’ de l’ARNm. De façon intéressante, l’apparition de ces intermédiaires n’est pas le résultat de l’activité de l’exosome mais de la déadénylase Pop2/Ccr4 elle-même. En parallèle de ce projet, nous avons également étudié le mécanisme de NMD (Nonsense-Mediated- Decay) in vivo et nous avons plus particulièrement recherché de nouvelles protéines pouvant être impliquées dans ce processus. Nous avons utilisé différents outils analytiques tels que la purification TAP (Tandem Affinity Purification) permettant d’identifier des complexes protéiques ou encore le système de ciblage de facteurs sur desARNm que nous avons validé par les résultats obtenus avec la déadénylase. Nous avons finalement entrepris un projet de reconstitution des mécanismes de dégradation in vitro. Nous avons en premier lieu mis au point un extrait cellulaire de levure capable de traduire des ARNm exogènes en raison des liens qui existent entre traduction et dégradation. Nous avons également construit différentes séries de plasmides permettant de transcrire in vitro des ARNm rapporteurs afin d’étudier différentes voies de dégradation.