Développement d'une stratégie thérapeutique pour la dystrophie musculaire de Duchenne : Restauration du cadre de lecture par saut d'exon

Developpement of a therapeutic strategy for Duchenne muscular dystrophy : restoration of the open reading frame by exon-skipping

• Auteur / Autrice : Aurélie Goyenvalle
• Direction : Olivier Danos
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie. Virologie fondamentale
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Exons

Myopathie de Duchenne

Thérapie génique

Myopathie pseudo-hypertrophique de Duchenne

Résumé

La plupart des cas de Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) sont causés par des mutations dans le gène de la dystrophine qui interrompent le cadre de lecture de l'ARNm. Dans certains cas, l'exclusion artificielle d'un exon permet de restaurer ce cadre de lecture, donnant naissance à une dystrophine plus courte, mais tout de même fonctionnelle. L'objectif de ce travail a été de produire in situ à partir de vecteurs viraux, des molécules d'ARN ciblant les sites spécifiques d'épissage du gène de la dystrophine, pour induire le saut des exons associés à la maladie pendant l'épissage du pré-ARNm. Pour cela, nous avons choisi d'utiliser le petit ARN nucléaire U7 (U7snRNA) comme « navette » et avons dans un premier temps construit un vecteur AAV spécifique du gène de la dystrophine murine, permettant un saut très efficace de l'exon ciblé. Ce saut d'exon induit ainsi une restauration massive et stable de dystrophine, associée à une amélioration significative du phénotype dystrophique chez la souris. En parallèle de ces travaux sur le modèle murin mdx, nous avons développé cette approche sur le modèle canin GRMD de la dystrophie musculaire de Duchenne, et mis en évidence l'efficacité du saut d'exons multiples permettant une restauration importante de dystrophine. Ces résultats très prometteurs obtenus chez la souris mdx et chez le chien GRMD, nous ont conduit à appliquer cette stratégie sur le gène humain de la dystrophine et en particulier sur l'exon 51 pour lequel nous avons pu mettre en évidence un saut d'exon très efficace. L'ensemble de ces résultats indique l'efficacité de l'approche du saut d'exon médiée par U7snRNA, qui pourrait concerner près de 80% des patients DMD.

Most cases of Duchenne muscular dystrophy (DMD) are caused by dystrophin gene mutations that disrupt the mRNA reading frame. In some cases, forced exclusion of a single exon can restore the reading frame, given rise to a shorter, but still functional dystrophin protein. Our objective in this work was to produce antisense sequences targeting splice junctions of dystrophin gene to induce removal of disease-associated exons during pre-mRNA processing. To achieve this exon-skipping, we proposed to use the U7 small nuclear RNA as carrier and we first developed AAV vectors harboring chimeric U7snRNA carrying antisense sequences able to promote skipping of exon 23 of the murine dystrophine gene. After intramuscular or intra-arterial injection in mdx mice, we detected efficient skipping of the exon 23 and a long term rescue of dystrophin expression. We next evaluated this strategy in the canine GRMD model and showed the possibility to skip several exons, leading to a very large restoration of dystrophin in injected muscles. These promising results obtained on the mouse and canine models led us to develop the strategy on the human dystrophin gene and especially on the exon 51. We confirmed the skipping of the exon 51 both in vitro in patient myoblasts after transduction with the lentiviral vector and in vivo after intramuscular injection of an AAV-U7ex51 vector in the transgenic hDMD mouse. This study provides evidence on the efficiency of the U7snRNA mediated exon skipping strategy for Duchenne muscular dystrophy, that could concern more than 80% of patients and offers very promising tools for clinical treatment of DMD.