Expression et purification de protéines membranaires mammifères impliquées dans des pathologies

Expression and purification of mammalian membrane-bound proteins involved in human diseases

• Auteur / Autrice : Matthieu de Rivoyre
• Direction : Isabelle Mus-Veteau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Nice
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transduction du signal cellulaire

Pichia

Saccharomyces cerevisiae

Protéines membranaires

Résumé

À l’interface entre la cellule et le milieu extérieur, les protéines membranaires ont un rôle indispensable au fonctionnement cellulaire. Elles jouent un grand nombre de fonctions et peuvent être impliquées dans des pathologies graves. La connaissance de ces protéines membranaire peut permettre de mieux comprendre de nombreux phénomènes biologiques et pathologiques et leur localisation, accessible, en fait de bonne cibles thérapeutique. La connaissance de la structure des protéines apporte une quantité d’information très importante sur leur fonctionnement. À ce jour si plusieurs dizaines de milliers de structures de protéines solubles ont pu être résolues, moins de deux cents structures de protéines membranaires sont connues. Cette différence provient des difficultés à produire des protéines membranaires pures et stables en quantités nécessaires à la détermination des structures tridimensionnelles. Les conditions d’expression des protéines membranaires est très variables en fonction de la protéine. Notre équipe de recherche s’intéresse au développement de stratégies pour l’expression hétérologue et la purification de protéines membranaires impliquées dans des pathologies humaines dans le but d’en étudier la structure et les relations structurefonction et par une approche protéine. Dans cette thèse sont présentés les résultats obtenus sur l’expression et la purification des récepteurs humains de la voie de signalisation Hedgehog, Patched et Smoothened, dont le disfonctionnement est mis en cause dans de nombreux cancers mais également dans des maladies neuro-dégénératives. Ces protéines ont pu être exprimées dans différents systèmes hétérologues : les levures Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris et dans les Cellules S2 de drosophile. Nous avons pu mettre en évidence que Smoothened était exprimé sous sa forme native dans les levures et qu’il était possible de la purifier et la produire dans l’optique d’une étude structurale à partir de Pichia pastoris (de Rivoyre et al, FEBS letters, 2005). Patched et Smoothened ont également pu être exprimé stablement et fonctionnellement par des clones de cellules S2. Ce système qui permet la purification de ces protéines s’est également avéré très intéressant pour une étude comparative du fonctionnement des protéines humaines et des protéines de drosophile (de Rivoyre et al, JBC, 2006).

Membrane-bound proteins play a significant role in cell function due to their position in between the cell and the external medium. These proteines are for this reason, involved in a number of human diseases. Knowing membrane-bound proteins will allow us to better understand several biological and pathophysiological functions. Furthermore, their localisations make them interesting therapeutic targets. Knowing the structure of proteins gives a tremendous amount of information on their functions. To date, even if several thousands structures of soluble proteins have been solved; only less than two hundred structures of membrane-bound proteins are known. This important difference is partly due to the fact that membrane-bound proteins are difficult to obtain pure in a stable conformation in order to determine their three-dimensional structures. Recombinant expression of membrane-bound proteins has a high variability depending on the nature of the protein studied. Our research team is therefore interested in the development of recombinant expression and purification strategies of membrane-bound proteins involved in numerous human diseases, in order to study their functions but also to establish structurefunction relationships. My thesis work has focused on the expression and the purification of human receptors of the Hedgehog pathway, Patched and Smoothened. Alteration of these two proteins is known to be involved in numerous cancers but also in some neurological diseases. These two proteins have been expressed in two different systems : yeast cells Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris and also in drosophila cells S2. We have been able to show that the protein Smoothened is expressed in Pichia pastoris in its native conformation in yeast cells an dit is therefore possible to purify it in order to perform structural studies. Patched and Smoothened have also been stably and functionaly expressed in S2 cells. This system is also interesting to perform comparative studies between drosophila and human proteins.