Mécanisme d'insertion membranaire du domaine de translocation de la toxine diphtérique et application à l'immunothérapie anti-tumorale

par Aurélie Perier

Thèse de doctorat en Biochimie. Biophysique

Sous la direction de Daniel Gillet.

Soutenue en 2006

à Paris, Muséum national d'histoire naturelle , dans le cadre de École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris) .

Le président du jury était Max Goyffon.

Le jury était composé de Vincent Forge, André Ménez, Daniel Gillet.

Les rapporteurs étaient Bruno Beaumelle, Michel Desmadril.

mots clés

• Cellules -- Interaction
• Toxines diphtériques
• Histidine
• Protéines membranaires

Résumé

La toxine diphtérique (DT), agent responsable de la diphtérie, est une toxine produite par une bactérie, Corynebacterium diphtheriae. Elle est composée de trois domaines : un domaine catalytique (C), un domaine de translocation (T) et un domaine de liaison au récepteur (R). Après liaison à un récepteur cellulaire, la DT est internalisée par endocytose. Dans l’endosome, l’acidification du pH conduit à un changement de conformation du domaine T qui s'insère dans la membrane de l'endosome et participe à la translocation vers le cytosol du domaine catalytique, toxique pour la cellule. À pH acide, le domaine T adopte un état partiellement replié, caractéristique de l'état molten globule : maintien des structures secondaires, rupture des interactions tertiaires, et exposition au solvant de zones hydrophobes organisées. Cet état est compétent pour s'associer aux membranes. Nous avons montré qu’à mesure que le pH décroît, la protonation d’histidines déclenche la formation de l’état molten globule et la liaison à la membrane. De pH 7 à pH 4, des interactions hydrophobes puis électrostatiques sont séquentiellement requises entre le domaine T et la membrane pour aboutir à un état inséré et fonctionnel. Ces deux types d’interactions impliquent des régions distinctes. La première étape correspond à la liaison du domaine T aux membranes par interactions hydrophobes. L’acidification progressive du milieu conduit dans une seconde étape à une réorganisation structurale du domaine T, contrôlée par une balance d'interactions électrostatiques attractives et répulsives entre les hélices N-terminales amphiphiles et la membrane. Cette étape aboutit à l’acquisition d’une structure insérée, compétente pour transloquer le domaine catalytique dans le cytosol de la cellule. Nous utilisons le domaine T comme une ancre membranaire afin d’accrocher des protéines solubles à la surface de cellules. Cette technique permet de modifier leur surface, et ainsi de manipuler leurs fonctions de signalisation, de liaison, de reconnaissance ou de stimulation. Une des applications possibles est la conception de vaccins contre le cancer. Nous avons donc fusionné une cytokine, le Flt3-Ligand, en position N-terminale du domaine T. Nous montrons que cette technique permet de moduler la communication entre cellules, notamment par des contacts directs entre les cellules porteuses de la cytokine et les cellules cibles portant le récepteur correspondant.

Résumé

The diphtheria toxin (DT), secreted by Corynebacterium diphtheriae, is a protein responsible for the major symptoms of diphtheria. The toxin is organized in three specialized domains: a catalytic domain, a translocation domain and a receptor binding domain. During the intoxication of a cell, the diphtheria toxin binds to a cell surface receptor, is internalized and reaches the endosome. The translocation domain (T) from the toxin interacts with the membrane of the endosome in response to the acidic pH found in this compartment. This process drives then the passage of the catalytic domain of the toxin in the cytoplasm. At acidic pH, the T domain undergoes a conformational change and adopts a partially folded state with characteristics of a molten globule state: it preserves native-like helices, looses tight packing of side chains and exposes hydrophobic clusters to the solvent. This state is competent for membrane interaction. We have found that, as the pH decreases, protonation of histidines was required for the formation of this molten globule state and membrane interaction. The interaction of the T domain with the membrane involves at least two steps. Firstly, the binding at the membrane surface involves hydrophobic interactions of the C-terminal region. Secondly, penetration into the membrane correlates with the reorganization of the N-terminal region in the membrane and is mainly driven by electrostatic interactions. This step leads to a functional inserted state. We used the T domain as a protein membrane anchor for soluble proteins. Attaching proteins to the surface of cells may have applications in biotechnology and cell engineering. Modifying cell surface should allow changing cell signalling, cell adhesion, cell recognition or cell stimulation. One application is the design of anti-cancer vaccines by attachment of cytokines. We have fused the Flt3-ligand to the N-terminus of T domain. We show that this method allows us to modify cell growth by direct contacts between cells.