Etudes structurales du facteur de transcription EthR de Mycobacterium tuberculosis impliqué dans la résistance à l'antituberculeux éthionamide : progrès dans l'analyse structurale des interactions entre le récepteur nucléaire LXRβ humain et des ligands candidats médicaments

• Auteur / Autrice : Frédéric Frénois
• Direction : Vincent Villeret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Biochimie
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Lille 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Éthionamide

Thioamides

Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis

Récepteurs cytoplasmiques et nucléaires

Récepteurs nucléaires (biochimie)

Antituberculeux

Antituberculeux

Résumé

Partie1: L'éthionamide 5ETH) est un antituberculeux de seconde-ligne utilisé pour le traitement de patients infectés par des souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes. Bien que ETH soit un analogue structural de l'isoniazide, seule une faible résistance croisée à ces deux médicaments est observée. Deux gènes ont été récemment identifiés chez M. Tuberculosis, Rv3854c (ethA) et Rv3855 (ethR), comme étant impliqués dans la résistance à ETH. Le gène ethA code une protéine qui appartient à la famille des monooxygénasase à flavine, et le gène ethR code un régulateur appartenant à la famille des régulateurs transcriptionnels TetR/CamR. La monooxygénase EthA est capable de transformer ETH d'une forme inactive en une forme active par S-oxydation, indiquant que ETH est un pro-médicament. Le gène ethR code un répresseur transcriptionnel qui régule négativement l'expression de ethA. Le gène ethR interagit avec la région promotrice longue de 75pb de ethA (Engohang-Ndong et al. 2004) et il est ainsi responsable de la faible activation de ETH par ethA. Contrairement aux autres membres de la famille TetR/CamR qui classiquement lient des opérateurs de 15 pb, EthR reconnaît une région anormalement longue de 55pb avec huit molécules de EthR liant coopérativement l'opérateur. D'un point de vue mécanistique, toutes ces données fonctionnelles sont dans l'attente d'analyses structurales pour être décrites à un niveau moléculaire. Ceci a constitué le sujet de la première partie de la thèse. Nous avons entrepris l'étude de la protéine EthR exprimée dans E. Coli K12 et nous avons déterminé la structure tridimensionnelle de EthR par SAD (Single Anomalous Diffraction). La structure révèle la présence d'un ligand fortuit qui a été capturé durant l'expression et identifié en spectrométrie de masse comme étant l''exadécyloctanoate (HecOc). L'analyse structurale révèle aussi que l'HexOc est capable d'induire EthR dans une conformation ne permettant pas la fixation sur l'ADN opérateur cible. Comme EthR est un répresseur présent chez Mycobacterium tuberculosis, nous avons conséquent exprimé le répresseur dans une mycobactérie afin de déterminer si la protéine est aussi capable de capturer le ligand dans un système d'expression homologue. De ce fait, EthR a été exprimé dans Mycobacterium smegmatis, purifié et cristallisé. Nous avons déterminé la structure 3D par la méthode de remplacement moléculaire. L'analyse de la structure a révélé la présence d'un ligand la présence d'un ligand fortuit similaire en composition chimique à celui identifié au niveau de la structure de '' E. Coli ''. L'identification du ligand par spectrométrie de masse est restée jusqu'à maintenant sans succès. Néanmoins, sa caractérisation à partir de la densité électronique suggère que les vraies ligands de EthR doivent être reliés à la voie de synthèse ou de dégradation des acides mycoliques dans les mycobactéries. D'autre part, la présence dans E. Coli de molécules telles que l'HexOc reste inexpliquée. L'expression de EthR dans une autre souche de E. Coli , E. Coli C41, révèle que l'HexOc n'est pas présent au niveau du site de liaison au ligand, mais a été remplacé par 2 molécules cycliques qui étaient capables d'induire EthR. Ces données structurales ont permis de définir un pharmacophore censé induire EthR dans une conformation ne permettant pas la fixation sur l'opérateur. En collaborationavec les équipes de microbiologistes et de chimistes, un programme de conception de médicaments basé sur la structure a été initié. Les premiers hits ont été identifiés, et deux des composés les plus prometteurs ont été co-cristallisés avec EthR. Ces structures sont présentées. D'un point de vue thérapeutique, ces composés devraient permettre d'agir en synergie avec l'éthionamide en augmentant l'activation de ETH par EthA, et ainsi de réduire les doses d'ETH requises pour traiter les patients. Les effets secondaires de la drogue devraient également être réduits. Finalement, nous avons continué l'étude structurale de EthR à un niveau plus fondamental, en analysant les structures de quelques mutants de EthR exprimés dans E. Coli K12. Ces mutants ont été conçus dans le but d'étudier les caractéristiques du site de liaison au ligand qui ont été mis en lumière à partir des analyses structurales préalables. Partie 2: Les LXRs (Liver X Receptor) sont des récepteurs nucléaires importants qui ciblent de nombreux gènes associés au transport et à la régulation du cholestérol. En particulier, ils agissent sur des produits de gènes en bloquant l'accumulation de cholestérol dans les lésions arthérosclérotiques, qui sont à l'origine de maladies cardiovasculaires. La recherche d'agonistes des LXRs constitue actuellement des domaines de recherche prioritaires de nombreuses industries pharmaceutiques. Le but de la seconde partie de la thèse a été de progresser dans la détermination du domaine de liaison au ligand (LBD) de LXRβ en complexe avec des ligands candidats-médicaments. Nous avons développé un protocole d'expression et de purification pour ce récepteur nucléaire qui souligne le rôle crucial du ligand dans la stabilisation de LXRβ. Nous avons tout d'abord étudié l'expression de LXRβ avec son agoniste stéroïdien naturel, l'époxycholestérol, pour tester les capacités d'expression de nombreuses constructions plasmidiques élaborées en collaboration avec les '' Laboratoires Fournier ''. Ensuite, nous avons testé d'autres ligands conçus et synthétisés par nos collaborateurs, dans le but d'augmenter nos chances d'obtenir un cristal. Un ligand nous a permis d'obtenir des cristaux de petite taille apparus après plus de 5 mois et grâce à un kit de cristallisation commercial. Cette condition a ensuite été affinée afin d'obtenir des cristaux de taille convenable, utilisables pour des tests de diffraction. Un jeu de données à l'ESRF a été enregistré avec notre meilleur cristal qui appartient au groupe d' espace P6522. La structure qui a été déterminée par la méthod de remplacement moléculaire avec un jeu de données limité à 4Å de résolution est brièvement présentée. Malheureusement, la limite de résolution ne nous a pas permis de décrire le ligand dans la cavité de LXRβ. Nous sommes actuellement en cours d'amélioration de la qualité de ces cristaux, afin de caractériser le processus de liaison du ligand à un niveau moléculaire.

Part1: Ethionamide (ETH) is a second-line drug used for the treatment of patients infected by multiresistant strains of Mycobacterium tuberculosis. Although ETH is a structural analogue of isoniazid, only a weak cross-resistance to these two antibiotics is observed. Two genes have been identified in Mycobacterium tuberculosis, RV3854c (ethA) and Rv3855 (ethR) as being involved in ETH resistance. The gene ethA codes for a flavin monooxygenase and the gene ethR codes for a trancription factor that belongs to the TetR/CamR family. The monooxygenase EthA is able to process ETH from an inactive form to an active form by S-oxydation, revealing that ETH is a pro-drug. The gene ethR codes for a transcriptional repressor which regulates negatively the expression of EthA. EthR interacts with the 75 bp promoter region of ethA (Engohand-Ndong et al. , 2004) and is thus responsible for the low activation of ETH by EthA. Unlike other TetR/CamR family members which classically bind operator region of 15bp, EthR recognizes an unusually wide region of 55bp with eight molecules of EthR binding cooperatively to the operator. From a mechanistic point of view, all these functional data are awaiting structural analyses in order to be characterized at the molecular level. This is the purpose of the first part of the thesis. We have carried out a structural study of EthR expressed in E. Coli K-12 strains, and we have determined the first 3D structure of EthR by the SAD (Single Anomalous Diffraction) method. The structure reveals the presence of a fortuitous ligand that has been captured during protein expression, identified by mass spectrometry as a molecule of hexadecyl octanoate (HexOc). The structural analysis also reveals that the HexOc is able to induce EthR, resulting in a conformation unable to bind to its DNA target operator. As EthR is a repressor from Mycobacterium tuberculosis, we have subsequently expressed it in Mycobacteria, in oder to investigate whether the protein was also able to capture a ligand in an homologous expression host. Thus EthR was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and crystallized. We have determined this 3D structure by the molecular replacement method. The structure analysis has revealed the presence of a fortuitous ligand similar in chemical composition to that identified in the '' E. Coli '' structure. Identification of this ligand by mass spectrometry has been so far unsuccessful. Nevertheless its characterization from the electron density suggests that true EthR ligands may be related to pathways of synthesis or degradation of mycolic acids in Mycobacteria. On the other hand, the presence in E. Coli of molecules such as the HexOc remains unexplained. Expression of EthR in another E. Coli strain (C41) revealed that the HexOc was not present anymore in the ligand binding site, but was replaced by cyclic molecules that were still able to induce EthR. Altogether, these structural data have allowed to define a pharmacophore expected to induce EthR in a conformation unable to bind to its DNA operator. In partnership with the microbiology and chemistry teams, aprogram of structure-based drug design has been initiated. The first hits have been identified, and two of the most promising compounds have been co-crystallized with EthR. These structures are presented. From a therapeutic point of view, these compounds would allow to act in synergy with ETH, by increasing ETH activation by EthA, thus reducing the ETH doses required to treat the patients, lowering the important side effects of this drug. Finally we have studied EthR at a more fondamental level by analysing structures of several mutants expressed in E. Coli K12. These mutants were designed in oder to investigate important features of the ligand binding site that were highlighted from previous structural analyses. Part 2: LXRs (Liver X Receptors) are important nuclear receptors that target several genes associated to the transport and regulation of cholesterol. In particular, they act on gene products blocking the accumulation of cholesterol in artherosclerosis lesions, a major cause of cardiovascular deseases. The research of LXRs agonists constitutes at the present time a very active domain in the pharmaceutical industry. The aim of the second part of the thesis was to progress in the structure determination of the ligand binding domain (LBD) of LXRβ in complex with ligands that are drug candidates. We have developed an expression and purification protocol for this nuclear receptor, which underlines the crucial rôle of the ligand in the stabilization of LXRbeta. We hav first studied the expression of LXRβ with its natural steroid agonist epoxycholesterol, evaluating this way the expression capabilities of the various plasmid constructions elaborated in collaboration with the '' Laboratoires Fournier ''. Next we have turned to other ligands designed and synthesized by our collaborators, in order to improve the expression level and the stability of the LXRbeta LBD, with the hope to increase our chances of getting crystals. One ligand has allowed us to obtain small crystals that appeared after 5 months with a commercial kit. This condition has been subsequently refined and allowed to obtain crystals that could be used in diffraction experiments. Diffraction data have been determined by the molecular replacement method with a diffraction data set limited at 4Å resolution, is briefly presented. Unfortunately this limited resolution does not allow us to already discuss ligand binding in LXRbeta. We are now in the process of improving the quality of these initial crystals, in order to be able to characterize the ligand binding process at the molecular level.