Thèse soutenue

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Auteur / Autrice : Claire Moulis
Direction : Magali Remaud
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Microbiologie et catalyse industrielles
Date : Soutenance en 2006
Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Résumé

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La dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F catalyse à partir de saccharose la synthèse d’un polymère d’unités glucosyle appelé dextrane, dont plus de 95% des liaisons sont de type alpha-1,6. Ce polysaccharide trouve diverses applications, essentiellement dans la formulation de composés pharmaceutiques, mais aussi comme support de chromatographie et depuis peu comme agent texturant. L’objectif de cette thèse était d’approfondir l’étude des relations structure-fonction de cette dextrane-saccharase, afin de construire par ingénierie rationnelle des catalyseurs produisant des dextranes de taille, de structure et donc de propriétés physico-chimiques contrôlées. L’expression hétérologue du gène dsrS dans E. Coli a été améliorée d’un facteur 30. Une forme tronquée a été construite de manière à pouvoir purifier le catalyseur à homogénéité et disposer, pour la première fois, d’une préparation pure de dextrane-saccharase spécifique des liaisons alpha-1,6. Un suivi cinétique de la synthèse de dextrane nous a permis de mettre en évidence la formation de produits de taille intermédiaire au cours de la réaction, dont la concentration et la taille augmentent au cours du temps. Un mécanisme de polymérisation de type « semi-processif » n’impliquant qu’un seul site actif pour l’élongation des dextranes peut donc être aujourd’hui proposé, mettant fin à une trentaine d’années de polémiques. Enfin, l’identification de déterminants structuraux impliqués dans ce mécanisme nous a permis de construire des formes tronquées synthétisant en une seule étape et avec des rendements très avantageux (de 69 à 75 %) les dextranes de 10 000 et 40 000 Da les plus utilisés à l’heure actuelle. Le motif minimal de DSR-S responsable de l’affinité pour le dextrane a également été identifié, et la potentialité d’utiliser ce peptide comme étiquette d’affinité pour des purifications sur gel Sephadex® évaluée