Structural and functional studies of NOD1

• Auteur / Autrice : Florence Filippetto-Manon
• Direction : Stephen Cusack
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résonance magnétique nucléaire

Inflammation

Mots clés libres

Nod1

Card4

Rick

Rip2

Cardiak

Card

Immunité innée

Apotose

Paquet de 6 hélices

Nf-кb

Résumé

NOD1 est une protéine de surveillance intracellulaire jouant un rôle crucial dans la défense immunitaire innée. Suite à la reconnaissance d'un ligand bactérien spécifique, NOD1 recrute RICK au moyen d'une interaction CARO-CARO. RICK module ensuite l'activation du facteur de transcription NF-KB et initie une cascade de signalisation pro-inflammatoire. Le but de cette thèse était de déterminer la base structurale de ce processus. Le domaine CARO de NOD1 a été cloné, exprimé et purifié à la station EMBL de Grenoble. La structure de ce domaine a été résolue par résonance magnétique nucléaire à l'IBS de Grenoble. Cette structure est généralement similaire à celle des autres domaines CARO connus, étant constituée d'un paquet compact de 6 hélices a. Cependant elle présente des caractéristiques inhabituelles concernant la conformation de certaines boucles inter-hélices ainsi que la longueur et l'orientation de la sixième hélice. Des mutations dans les domaines CARDs des protéines NOD1 et RICK entières ont été réalisées pour identifier les résidus importants pour l'interaction ou la signalisation. Des expériences de co immunoprécipitation et d'activation de NF-KB ont été effectuées à l'Université du Michigan. Trois résidus d'un patch acide de NOD1 (E53, 054 et E56) et trois résidus d'un patch basique de RICK (R444, R483 et R488) sont indispensables à l'interaction, qui serait donc de nature électrostatique. Deux autres résidus du patch acide du CARO de NOD1, L44 et 157, ont été identifiés comme importants pour la signalisation. Ils peuvent potentiellement contribuer à la formation d'une interaction CARO-CARO fonctionnelle, ou bien également interagir avec d'autres régions de RICK.

NOD1 is a cytosolic signaling host pattern-recognition receptor playing a crucial role in innate immunity. It regulates pro-inflammatory pathways by mediating the activation of the nuclear factor NF-KB via its downstream effector RICK following the recognition of a specific bacterial ligand. RICK is recruited by NOD1 through a CARO-CARO interaction. The goal of this thesis was to determine the structural basis of this process. NOD1 CARO was cloned, expressed and purified at the Grenoble EMBL Outstation. Its structure was determined by nuclear magnetic resonance at the IBS in Grenoble. It is generally similar to other CARDs of known structure, consisting of six tightly packed a-helices, although the conformation of sorne of the inter-helical loops and the orientation and length of the last helix are unusual. Mutations in the CARO domains of both NOD1 and RICK full-Iength proteins were made in order to define residues important for CARO-CARO interaction. Co-immunoprecipitation of cell Iysates and NF-KB activation assays were performed at the University of Michigan Medical School. The results suggest that the interaction is primarily electrostatic and dependent on a patch of three acidic residues on NOD1 CARO (E53, 054, and E56) and three basic residues on RICK CARO (R444, R483 and R488). Ln addition, two amino acids L44 and 157, located in or close to the acidic patch of NOD1 were found to affect NOD1 signaling. These could be involved in the precise formation of a functional CARO-CARO interaction, or they could interact with other regions of RICK than the CARO domain.