Etude fonctionnelle de la nitrate réductase périplasmique de Rhodobacter sphaeroides par spectroscopie RPE et électrochimie directe

EPR and direct electrochemistry studies of the Rhodobacter sphaeroides periplasmic nitrate reductase

• Auteur / Autrice : Bettina Frangioni
• Direction : Bruno Guigliarelli
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences chimiques. Physico-Chimie, Analyse et spectrométries moléculaires
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 1
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Provence. Section sciences

Mots clés

Mots clés contrôlés

Oxydoréductases

Spectroscopie moléculaire

Enzymes

Modèles chimiques

Résumé

La nitrate réductase périplasmique de Rhodobacter sphaeroides, NapAB, est une enzyme à cofacteur à molybdène mononucléaire appartenant à la famille d’enzymes bactériennes de la DMSO réductase. Cette enzyme catalyse un transfert de groupement oxo, mettant en jeu deux électrons et deux protons : NO3- + 2e- + 2H+→ NO2- + H2O. L’un des objectifs de ce travail a été de mener les caractérisations spectroscopiques et rédox du système dans sa globalité. NapAB est un système modèle car sa constitution de complexité intermédiaire au sein de la famille de la DMSO réductase, permet d’étudier le transfert d’électrons à l’intérieur et entre les deux sous-unités. De plus, la possibilité de travailler sur la sous-unité NapA isolée nous a permis d’étudier l’effet de l’assemblage de sous-unités protéiques sous la forme d’un complexe rédox multicentre. Enfin, l’objectif principal de ces travaux a été d’apporter de nouveaux éléments pour la compréhension d’un mécanisme catalytique probablement voisin chez toutes les enzymes de famille de la DMSO réductase. Nous avons utilisé la spectroscopie RPE couplée à des titrages potentiométriques pour caractériser le système. L’observation du signal hèmique a nécessité une étude par spectroscopie RPE multifréquence. L’électrochimie directe nous a permis d’étudié l’activité catalytique de NapAB en fonction de la concentration en substrat et du pH. En électrochimie, NapAB présente un signal catalytique complexe, non monotone. A partir des données expérimentales, nous avons conçu un modèle de mécanisme catalytique et conduit la première analyse quantitative d’un signal catalytique de ce type. Par RPE, nous avons identifié différents signaux de molybdène V et leurs rôles dans la catalyse. L’étude des enzymes mutées nous a permis d’identifier le rôle dans la lisaion du substrat de l’arginine 392.

Rhodobacter sphaeroides periplasmic nitrate reductase NapAB is a mononuclear molybdenum enzyme which belongs to a bacterial enzyme family, the DMSO reductase family. This enzyme catalyses an oxo transfer with two electrons and two protons NO3- + 2e- + 2H+ → NO2- + H2O. The spectroscopic and redox characterization of the global system was one of the aims of this study. NapAB is a model because its constitution is intermediary in the DMSO reductase family. This structure allows to study electron transfer inside and between the two sub-units. Moreover, works on the isolated NapA sub-unit provided information about the effect of the protein folding. Then the principal aim of these works was to supply new elements in the understanding of a catalytic mechanism probably similar among the enzymes of the DMSO reductase family. EPR spectroscopy coupled with redox titrations were used to characterize the system. A multifrequency EPR spectroscopy study was conducted to observe the hemes. Catalytic activity of NapAB in function of substrate concentration and pH was studied by direct electrochemistry.