Développement de rapporteurs de repliement et de solubilité des protéines basés sur la GFP : application à la définition de domaines solubles de la polykétide synthase Pks13 de Mycobacterium tuberculosis

Development of GFP-based folding and solubility reporters : application to the definition of soluble domains of polyketide synthase Pks13 from Mycobacterium tuberculosis

• Auteur / Autrice : Stéphanie Cabantous
• Direction : Geoffrey S. Waldo, Lionel Mourey
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Solubilité

Protéines

Repliement des protéines

Mycobacterium tuberculosis

Évolution moléculaire

Mots clés libres

Protéine à fluorescence verte

Rapporteurs de repliement

Evolution moléculaire dirigée

Complémentation de fragments protéiques

Expression et solubilité des protéines

Génomique structurale

Criblage à haut débit(HTS)

Polykétide synthase

Domaines protéiques

Mycobacterium tuberculosis

Résumé

Ce travail décrit le développement de rapporteurs de repliement et de solubilité des protéines basés sur la GFP. La première technologie '' GFP insertion folding reporter '' consiste à insérer les protéines au sein de la GFP afin de discriminer des artefacts pouvant apparaître lors de l'évolution moléculaire. La combinaison de ce rapporteur avec la '' GFP superfolder '' a conduit à la création de rapporteurs chimères permettant une détection plus sensible du repliement des protéines. La deuxième technologie porte sur la conception d'un rapporteur de solubilité basé sur la complémentation de fragments de GFP. Une étiquette GFP est fusionnée à la protéine d'intérêt pouvant être détectée par complémentation avec le fragment de GFP complémentaire. Le système '' split-GFP '' permet de quantifier in vitro et in vivo l'expression et la solubilité des protéines. La combinaison des technologies '' GFP-insertion '' et '' split-GFP '' constitue une '' boîte à outils '' permettant d'augmenter la fraction soluble de variants protéiques. Enfin, un système de sélection de cadres de lecture a été combiné avec la technologie '' split-GFP '' pour isoler des domaines solubles de la polykétide synthase Pks13 de Mycobacterium tuberculosis.

This work describes the development of folding and solubility reporters based on GFP. The first technology, the GFP insertion folding reporter, is a modification of the C-terminal GFP folding reporter assay. Guest proteins are inserted inside the GFP scaffolding such that ribosome binding sites appearing during molecular evolution are discriminated. Several insertion GFP reporters with increasing sensitivity to test protein misfolding were created based on chimeras of folding reporter and superfolder GFP. The second technology is a solubility reporter based on engineered self-complementing fragments of GFP. The target protein is tagged with a small fragment of GFP, which is subsequently detected by complementation with the large fragment of GFP. The split GFP complementation system is suitable for both in vitro and in vivo protein solubility and expression screening. The folding and solubility reporter “toolbox” is applied to increase the soluble expression yield of normally-insoluble proteins. The second example illustrates how a novel open reading frame selector can be combined with the split GFP technology to trap soluble domains of a polyketide synthase Pks13 from Mycobacterium tuberculosis.