Sondes fluorescentes ratiométriques dérivées de la 3-hydroxyflavone : Propriétés photophysiques et applications en biologie cellulaire

Fluorescent ratiometric probes based on 3-hydroxyflavone derivatives : Photophysical properties and application in cellular biology

• Auteur / Autrice : Vasyl Shynkar
• Direction : Yves Mély
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plasmides

Moments dipolaires

Liposomes

Solvants organiques

Propriété

Flavones

Réactions de transfert de protons

Sondes fluorescentes

Résumé

Ce travail a eu pour objectif le développement de nouvelles sondes fluorescentes ratiométriques dérivées de la 3-hydroxyflavone (3-HF), dans le but d’étudier les membranes cellulaires. Les 3-HFs sont connues pour leur émission duale due à une réaction de transfert de proton intramoléculaire à l’état excité (ESIPT). La thèse a été réalisée en trois étapes. En premier lieu, nous avons étudié les propriétés photophysiques de dérivés de la 3-HF dans deux types de solvant organique, protique ou aprotique, par la technique de fluorescence résolue en temps. Cette étude nous a permis de développer un modèle cinétique pour l’ESIPT. Ce modèle a permis d’expliquer le mécanisme de la réponse de ces sondes au solvatochromisme et à l’électrochromisme par des déplacements de l’équilibre de l’ESIPT. La compréhension de ce mécanisme nous a procuré les bases pour concevoir de nouvelles sondes de polarité et de champ électrique. En outre, l’étude en solvants protiques a révélé la sensibilité de ces sondes à l’effet de la liaison hydrogène. Dans une seconde étape, nous avons appliqué le modèle développé précédemment pour analyser les propriétés de solvatochromisme et d’électrochromisme ainsi que l’hydratation membranaire dans des vésicules phospholipidiques. Les données obtenues ont confirmé la distribution bimodale des sondes 3-HF neutres dans la bicouche lipidique. De plus, nous avons montré que ces sondes 3-hydroxyflavones peuvent se mettre sous leur forme anionique dans des vésicules lipidiques de type anionique, ceci en présence de tampon HEPES même à pH neutre ce qui n’est généralement pas observé. En dernier lieu, ces sondes ont été appliquées pour des mesures de potentiels dipolaire et de surface de membranes plasmiques cellulaires. Ces mesures ont été effectuées par spectroscopie de fluorescence pour des cellules en suspension et par microscopie confocale pour des cellules adhérentes. L’application la plus importante de l’une des nouvelles sondes dérivées de la 3-hydroxyflavone a été l’exploration de la perte de l’asymétrie lipidique de la membrane plasmique cellulaire au cours de l’apoptose. Contrairement à la méthode de référence basée sur la sonde Annexin V-FITC, la réponse de cette sonde est indépendante de la concentration en Ca2+. En outre, notre sonde nécessite un temps d’incubation plus court, un protocole d’utilisation plus simple et donne une réponse indépendante de sa concentration locale. Elle pourrait donc largement se substituer à l’ Annexin V-FITC pour la détection de l’apoptose.

The aim of the present work was to develop new fluorescent ratiometric probes for biomembrane studies. These dyes are based on the 3-hydroxyflavone (3-HF) fluorophore, which is well-known for its dual emission, due to an Excited State Intramolecular Proton Tranfer (ESIPT) reaction. With this aim, the present work can be divided into three parts. First, we studied the photophysical properties of several 3-HF derivatives both in aprotic and protic organic solvents by time-resolved fluorescence techniques. This allowed us to develop a kinetic model of the ESIPT reaction. This model explains the mechanism of the dye responses to solvatochromism and electrochromism by shifts in the ESIPT equilibrium. This mechanism provides a unique possibility for designing sensors of polarity and electric fields. Moreover, using protic solvents, 3-HF probes were shown to be also highly sensitive to H-bonding effects. In a second step, we applied the previously developed kinetic model to analyze the solvatochromic and electrochromic properties, as well as the hydration of model membrane systems such as phospholipid vesicles. The obtained kinetic data confirm the bimodal distribution of neutral 3-HF dyes in lipid bilayers. Furthermore, we showed that in anionic phospholipids vesicles in the presence of HEPES buffer, it appears the anionic form of 3-HF molecules even at neutral pH that is usually not observed. Finally, these probes were applied for measuring the dipole and surface potentials of cell plasma membranes by fluorescence spectroscopy on cell suspensions and confocal microscopy on adherent cells. One major application of one of the newly developed probes was to explore the loss of lipid asymmetry of the cell plasma membrane during apoptosis. In contrast to the reference method based on fluorescently labeled Annexin V, the response of this dye is independent on Ca2+ concentration. Moreover, the dye requires shorter incubation times, is easier to handle and to prepare and enables quantities measurements that are independent on the local dye concentration. This dye could thus substitute the largely used Annexin V derivatives for apoptosis detection.