Localisation cellulaire de protéines fluorescentes isoprénylables dans des cellules de tabac BY-2

Intracellular distribution of prenylated fluorescent proteins in tobacco BY-2 cells

• Auteur / Autrice : Esther Gerber
• Direction : Thomas J. Bach
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire des plantes
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Isoprénoïdes

Cellules végétales

Protéine fluorescente verte

Protéines -- Modifications posttraductionnelles

Nicotiana tabaccum

Résumé

L'isoprénylation des protéines, processus fondamental chez tous les eucaryotes, est une modification post-traductionnelle impliquant l'attachement covalent de résidus isopréniques en C15 (farnésyl) ou C20 (géranylgéranyl) sur une cystéine appartenant à un motif de type CaaX situé à leur extrémité C-terminale. Au cours de ce travail, nous avons construit un outil biologique expérimental permettant de visualiser, dans des cellules de tabac BY-2, l'isoprénylation de protéines chimères fusionnées à la GFP et porteuses de sites potentiels de farnésylation ou de géranylgéranylation. Ces protéines chimères ont été construites à partir des séquences terminales de la calmoduline de riz (OsCaM61) et d'une Rop d'Arabidopsis thaliana (AtRop6). Les résultats obtenus démontrent clairement que les protéines isoprénylées, farnésylées ou géranylgéranylées, sont associées majoritairement à la membrane plasmique. L'inhibition de la réaction d'isoprénylation, par des inhibiteurs ou des mutations du motif CaaX, induit un changement de localisation intracellulaire des protéines cibles, qui s'accumulent dans le noyau, et plus particulièrement, dans le nucléole. Nous avons montré que la distribution intracellulaire de ces protéines, isoprénylées ou non, est indépendante du cytosquelette (microtubules et filaments d'actine) et de la présence de bréfeldine A. Grâce à l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques (mévinoline, fosmidomycine et kétoclomazone) de chacune des deux voies de biosynthèse des isoprénoïdes chez les plantes, cytosolique et plastidiale, nous avons démontré le rôle essentiel joué par la voie du MEP dans la synthèse du GGPP nécessaire à la géranylgéranylation des protéines. Cet outil apparaît comme particulièrement prometteur pour mettre en évidence in vivo les effets toxiques d'inhibiteurs spécifiques, pour mesurer des flux biosynthétiques ou pour tester de nouveaux herbicides et drogues, susceptibles d'interagir avec la voie du MEP ou la géranylgéranylation des protéines.

Isoprenylation of proteins, which has been recognized as a fundamental process in eukaryotic cells, consists in the formation of a chemically stable thioether bond between a cysteine residue belonging to a carboxyterminal CaaX motif and a C15 (farnesyl) or a C20 (geranylgeranyl) isoprenyl residue. In this study, we have developed an experimental system, allowing to visualize, in intact tobacco BY-2 cells, the isoprenylation of proteins fused to GFP and with motives for farnesylation or geranylgeranylation. Such proteins were constructed from terminal sequences of rice calmodulin (OsCaM61) or the Arabidopsis Rop6. Our results clearly demonstrate that the farnesylated or geranylgeranylated proteins are mainly associated with the plasma membrane. The inhibition of the isoprenylation reaction by inhibitors or mutations in the CaaX box triggers a change in the intracellular localization of the chimerical proteins. These proteins accumulate in the nucleus, especially in the nucleoli, instead of the plasma membrane. We also show that the intracellular distribution of the prenylated and non-prenylated proteins is not dependent on the cytoskeletal network (microtubules and microfilaments of actin) and on brefeldin A. By using specific inhibitors (mevinolin, fosmidomycin and ketoclomazone) of both isoprenoid biosynthetic pathways occurring in higher plants or metabolic intermediates (MVA, Fol, Gol and GGol), we provided evidence for the essential role played by the MEP pathway in the synthesis of GGPP needed for the geranylgeranylation of proteins in plants. Such an experimental system appears to be very useful to demonstrate toxic effects of specific inhibitors, to measure biosynthetic fluxes or to check new herbicides and drugs, which could interact with the MEP pathway or the geranylgeranylation of proteins.