Etude des interactions moléculaires spécifiques par spectrométrie de masse : application à la chimie du vivant

Study of specific molecular interactions using mass spectrometry : application in biology

• Auteur / Autrice : Guillaume Chevreux
• Direction : Alain Van Dorsselaer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie moléculaire et supramoléculaire
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biochimie

Biomolécules

Protéines -- Analyse

Interactions ion-molécule

Spectrométrie de masse

Dynamique moléculaire

Résumé

Le développement de nouvelles techniques d'ionisation dites " douces ", au début des années 90, marque un tournant décisif dans le domaine de la spectrométrie de masse. En particulier, la technique d'ionisation électrospray se révéla rapidement adaptée à l'analyse de macromolécules d'origine biologique. Par ailleurs, certaines preuves supportaient l'idée que des interactions moléculaires spécifiques entre plusieurs molécules en solution, pouvaient être préservées lors de l'analyse en phase gazeuse dans le spectromètre de masse. Ce travail de thèse explore le potentiel de la spectrométrie de masse dans l'étude des interactions moléculaires impliquant des biomolécules. Dans une première partie, nous avons développé et utilisé cette approche pour découvrir de nouvelles molécules à visée thérapeutique. Dans ce cadre, la spectrométrie de masse s'est imposée comme une technique d'analyse de choix permettant de caractériser des interactions spécifiques protéine/ligand. Une des applications majeure consiste à éliminer les faux positifs sélectionnés après un premier criblage sur une protéine cible. Dans une seconde partie, nous avons étudié différents mécanismes biologiques impliquant des interactions moléculaires. La fonction d'une protéine et donc son rôle au sein de la cellule, est modulée par des mécanismes de reconnaissance impliquant des interactions moléculaires non covalentes. En caractérisant finement les partenaires de complexes biologiques, la spectrométrie de masse a apporté des informations décisives sur des mécanismes biologiques au sein de la cellule (mécanisme de motilité, d'adhésion cellulaire et de lutte contre le stress oxydant). Dans une dernière partie, nous avons évalué les possibilités de la technique pour étudier la dynamique d'échange dans le temps de complexes. En visualisant en temps réel des stoechiométries d'interaction, il est en effet possible d'accéder à des données cinétiques telles que les constantes de dissociation de complexes biologiques.

The development of new soft ionization methods at the early nineties provided new insight in the application range of mass spectrometry. Thus, the new ionization technique called “electrospray” showed rapidly that it was well fitted for the analysis of biological macromolecular entities such as proteins. Moreover, first studies reported that supramolecular complexes in solution could be transferred intact in the gas phase of the mass spectrometer, allowing their study by mass spectrometry. The aim of this work is to explore the potential of electrospray ionization mass spectrometry for the study of non covalent complexes in the biological field. We have first developed instrumental conditions and methodologies allowing the discovery of new drugs. In this context, mass spectrometry rapidly appeared as a fruitful technique allowing the characterization of specific protein/ligand interactions. The main application consists in the validation of hits after high throughput screening applied on a therapeutic target. In a second part, we studied biological mechanisms based on various binding partners. The protein function in vivo is modulated by host/guest mechanisms implying non covalent molecular interactions. The accurate characterization of such binding partners, using mass spectrometry, was very useful for the comprehension of complex biological mechanisms such as the cellular motility, the adhesion process or the oxidative stress. In a last part, we used real time resolved mass spectrometry to explore the dynamic of non covalent complexes (subunit exchange, ligand dissociation). With this approach, it was possible to reach kinetic data such as dissociation constant, thus providing new perspectives for the characterization and understanding of biological complexes.