Thèse soutenue

Contribution du couplage CE-ICP/MS dans l'étude des interactions métals-protéine non-covalentes

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Auteur / Autrice : Jean Chamoun
Direction : Agnès Hagege
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie analytique
Date : Soutenance en 2005
Etablissement(s) : Strasbourg 1

Résumé

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Le criblage des interactions protéine/métal grâce à l’utilisation du couplage CE-ICP/MS a été étudié. La mise au point de ce nouvel outil analytique nécessite, outre un interfaçage de ces deux techniques, ine séparation efficace des protéines et une détection sensible des métaux. L’optimisation de la séparation électrophorétique d’un mélange de protéines-test a conduit à l’utilisation d’un tampon borate à pH 9,2, qui minimise l’adsorption et permet la séparation de toutes les protéines du mélange avec une bonne reproductibilité des temps de migration. L’interfaçage entre l’électrophorèse capillaire et l’ICP/MS a été réalisé à l’aide d’une interface avec une solution conductrice. L’optimisation des paramètres tels que débits des gaz, débit et composition de la solution conductrice et position du capillaire dans le micronébuliseur a été réalisée afin d’obtenir les meilleures sensibilité de détection et efficacité de séparation. Toutefois, ce type d’interface entraîne des dilutions importantes des échantillons, qui nous ont conduits à développer un système de préconcentration en ligne afin d’améliorer les limites de détection. Le calcul des limites de détection réalisé sur le cuivre et le zinc contenus dans l’anhydrase carbonique, protéine la moins efficacement concentrée, montre une amélioration des limites de détection en CE-ICP/MS de 6 fois pour le cuivre et 5 fois pour le zinc. Ce couplage a ensuite été utilisé dans l’étude des interactions de trois métaux de transition (Cd, Co et Ni) avec un mélange de protéines constitué de métalloprotéines et protéines majeures du sérum sanguin. Ces études montrent un comportement similaire du cobalt et du nickel, différant totalement de celui du cadmium. Dans le cas des métalloprotéines, le couplage CE-ICP/MS permet également de conclure quant à la nature probable des sites d’interaction. De plus, cette méthode a permis d’étudier l’affinité relative des différents métaux vis-à-vis du mélange de protéines. L’aspect dissociatif du couplage a également été exploité pour obtenir des données cinétiques, permettant l’accès aux constantes de dissociation des complexes et dans certains cas, à la mise en évidence de sites d’interaction multiples. Enfin, la technique a été appliquée à des cations dits « durs » : lanthanides et uranyle (UO22+). Les premiers résultats démontrent une adsorption massive de ces cations à la surface des capillaires. Néanmoins, les études réalisées sur un mélange de six protéines, préalablement identifiées comme cibles de l’uranium, montrent que quatre d’entre elles interagissent avec l’uranium, parmi lesquelles l’albumine et la transferrine.