Mesure cellule par cellule du nombre de copies de plasmide chez Escherichia coli

Cell by cell measurement of the number of plasmid copies in Escherichia coli

• Auteur / Autrice : Christian Rick
• Direction : Didier Chatenay
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytométrie de flux

Plasmides

Escherichia coli

Résumé

Toute l'information génétique nécessaire à la vie de la bactérie Escherichia coli est portée par son unique chromosome : une molécule d'ADN circulaire de 4,6 millions de paires de bases. En plus de son ADN chromosomique, une bactérie peut contenir des molécules d'ADN supplémentaires appelées plasmides. L'objet de cette thèse est la mise au point d'une expérience de mesure cellule par cellule du nombre de plasmides. Il s'agit de prendre, une par une, plusieurs milliers de bactéries et ensuite de compter le nombre de plasmides qu'elles contiennent. Pour cela nous avons utilisé des techniques de micro lithographie pour construire un dispositif constitué de réservoirs de 5 mm de diamètre reliés entre eux par un canal de 5 µm de large. Une goutte de liquide contenant les bactéries est déposée dans l'un des réservoirs. Une différence de hauteur de liquide et/ou une tension électrique appliquée entre les réservoirs permet de faire passer les bactéries d'un réservoir à l'autre, une par une, devant l'objectif d'un microscope inversé. Le nombre de plasmides dans la bactérie est mesuré de façon indirecte. Nous avons construit des plasmides qui portent tous un gène codant une protéine fluorescente verte, et lorsqu'une bactérie passe devant l'objectif du microscope nous mesurons la fluorescence de la cellule. Notre expérience repose sur l'hypothèse que le niveau d'expression est le même pour chaque copie du gène : la fluorescence de la cellule est alors proportionnelle au nombre de copies du plasmide. Cette thèse décrit l'expérience de microscopie de fluorescence ainsi que la construction des souches bactériennes. Les résultats préliminaires que nous avons obtenus montrent que le dispositif expérimental est au point : Lors d'une expérience, nous mesurons la fluorescence de plusieurs milliers de bactéries. Le signal est largement au dessus du bruit et les résultats sont reproductibles.

All the genetic information necessary to the life of Escherichia coli is carried by its unique chromosome: a 4. 6 million base pair circular DNA molecule. Besides its chromosomal DNA this bacterium can also contain additionnal DNA molecules called plasmids. The aim of this thesis is to build up an experiment to measure cell by cell the number of plasmids. The point is to take, one by one, thousands of bacteria and then measure the number of plasmids they contain. To do this we used micro lithography techniques to built a ship made of 5 mm diameter reservoirs linked together by a 5 µm wide channel. A drop of liquid containing the bacteria is transfered in one of the reservoirs. A difference in the liquide height and/or some voltage applied between the reservoirs allows to make the bacteria pass from one reservoir to the other, one by one, in front of the objective of an inverted microscope. The number of plasmids is measured indirectly. We built plasmids which all carry a gene coding for a green fluorescent protein, and when a bacteriun passes by we measure the fluorescence of the cell. Our experiment is based on the assumption that the level of expression is the same for each copy of the gene: the fluorescence of the cell is proportionnal to the number of plasmids. This thesis describes the fluorescence microscopy experiment and the construction of the bacterial strains. The preliminary results that we obtained show that our experimental setup works. (In one experiment we measure the fluorescence of thousands of bacteria: The signal is far above the noise and the results are reproducible.