Purification et étude de l’expression d’une pectine méthylestérase de lin : rôle de cette isoforme dans la rigidification de la paroi

Purification and study of the expression of a pectin methylesterase of flax : the role of this isoform in cell wall stiffening

• Auteur / Autrice : Suha Al-Qsous
• Direction : Pierre Alain Balangé
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie. Physiologie végétale
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Rouen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Stratégies antisens

Paroi cellulaire végétale

PCR (génétique)

Estérases

Pectine

Lin

Résumé

Les pectines méthylestérases (PME, EC. 3. 1. 1. 11) sont des enzymes pariétales qui catalysent la déméthylestérification des pectines. Chez les plantes supérieures, les PME existent sous de nombreuses isoformes et sont impliquées dans divers processus de développement. Trois gènes (Lupme5, Lupme3 et Lupme1) codant des PME ont été isolés de l’hypocotyle de lin (Linum usitatissimum). Au cours de ce travail, nous avons purifié une isoforme très basique (B2 pI 9. 5), qui se trouve sous une forme mature (35 kDa) au sein de la paroi. Nous nous sommes intéressés aussi à l’expression du gène codant cette isoforme (LuPME5). Pour mieux comprendre ses rôles possibles dans l’hypocotyle, nous avons comparé l’expression de Lupme5 avec celle des deux autres gènes dans les différentes zones d’élongation et de maturation de l’hypocotyle de plantules âgées de 4, 6 et 10 jours à l’aide de la RCT-PCR semi-quantitative. Cette technique nous a permis de montrer que Lupme5 est le gène le plus exprimé, mais aussi qu’il a un profil d’expression qui pourrait être lié à la rigidification de la paroi après élongation. Une construction contenant une séquence partielle de ce gène (comprenant la partie N-terminale, spécifique de LuPME5), insérée en orientation antisens, sous le contrôle du promoteur CaMV 35S, a été transférée dans le lin. Parmi les cals transgéniques antisens obtenus, certains ont présenté une baisse de l’expression de l’ARNm de Lupme5 et de l’activité PME et de la quantité de protéine révélée par Western blot. Une légère augmentation dans le pourcentage de méthylestérification de la paroi a été observée chez ces cals transgéniques, indiquant une certaine efficacité de la construction antisens.

Pectin methylesterases (PME, EC. 3. 1. 1. 11) are enzymes that demethoxylate pectins in the cell wall. Numerous PME isoforms exist in higher plants; these isoforms are known to play different roles in various developmental processes. Three genes (Lupme5, Lupme3 and Lupme1) encoding PME were isolated from flax (Linum usitatissimum) hypocotyls. We purified the mature LuPME5 isoform which was found to have a very basic isoelectric point (pI 9. 5) and a molecular mass of 35 kDa. In order to understand the possible roles of this isoform in the hypocotyls, we first performed a semi-quantitative RT-PCR in order to compare the expression levels of Lupme5 with Lupme3 and Lupme1. The expression of these genes was essayed in the different elongation and maturation zones of the hypocotyls of 4, 6 and 10 days old plants. The result showed that Lupme5 is the most expressed gene and that its expression profile could be correlated with the cell wall stiffening after elongation. A construct, containing a partial specific sequence of Lupme5 (in the antisense orientation) was introduced into flax genome. The antisense transformants displayed reduction in the levels of Lupme5 mRNA expression, crude PME activity and protein content. A slight increase in the degree of methylesterification of the cell wall was observed in the antisense constructs, indicating the functional efficiency of these constructs.