Etude de la biosynthèse de l'antibiotique spiramycine par Streptomyces ambofaciens

The biosynthesis of a macrolid antibiotic, spiramycin, by Streptomyces ambofaciens

• Auteur / Autrice : Fatma Karray
• Direction : Jean-Luc Pernodet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés libres

Macrolide

Métabolisme secondaire

Résumé

Streptomyces ambofaciens synthétise l'antibiotique macrolide la spiramycine. La région contenant les gènes de biosynthèse de la spiramycine a été séquencé chez S. Ambofaciens. L'analyse de cette séquence d'environ 100 kb révèle la présence de 50 gènes, dont 41 sont probablement impliqués dans la biosynthèse de spiramycine, dans sa régulation ou dans la résistance à la spiramycine. Afin d'étudier le rôle de ces gènes dans la biosynthèse de spiramycine, nous avons construit des souches dans lesquelles certains gènes ont été inactivés par délétion en phase. Pour cela, nous avons développé des cassettes excisables facilement par recombinaison spécifique de site. Deux gènes régulateurs, srmR et srmS, ont été identifiés parmi les gènes de biosynthèse de la spiramycine. L'inactivation de chacun de ces deux gènes abolit la production de la spiramycine tandis que la surexpression de chacun d'eux augmente d'un facteur trois le niveau de production de la spiramycine. L'analyse d'expression par RT-PCR de tous les gènes de biosynthèse de la spiramycine, chez la souche sauvage, dans les mutants srmR et srmS et dans le double mutant srmR, srmS, a été effectuée. Ces résultats indiquent que SrmR est nécessaire à l'expression de srmS ; SrmS contrôlant quant à lui l'expression de la plupart des gènes de biosynthése de la spiramycine. La spiramycine est produite sous forme d'un mélange de spiramycine I, II et III. La spiramycine I est la forme la plus active. Nous avons identifié et inactivé le gène, orf6*, codant l'acétyltransférase responsable de la production de la spiramycine II et III. Le niveau de production de spiramycine I a été augmenté en surexprimant srmR dans ce mutant. -

Streptomyces ambofaciens synthesizes the 16-membered macrolide antibiotic spiramycin. The biosynthetic gene cluster for spiramycin has been characterized in S. Ambofaciens. Sequence analysis of a region of more than 100 kb spanning the entire cluster revealed the presence of 50 genes, 41 of them being most probably involved in spiramycin biosynthesis, its regulation or resistance to the antibiotic. In order to study the role of the gene products in spiramycin biosynthesis, we constructed strains in which some genes were inactivated by in-frame deletion. For this purpose, we developed cassettes that can be easily excised by site-specific recombination. Two regulatory genes, srmR and srmS, were identified in the biosynthetic gene cluster. The disruption of each of these two regulatory genes eliminated spiramycin production while the over-expression of each of them increased three fold the level of spiramycin production. Expression analysis by RT-PCR for all the genes of the cluster in the wild type strain, in srmR and srmS deletion mutants and in the srmR, srmS double deletion mutant was performed. These results, together with complementation experiments, indicated that SrmR is required for srmS expression, SrmS being a pathway-specific activator that controls most of the spiramycin biosynthetic genes. Spiramycin is normally produced as a mixture of spiramycin I, II and III. Spiramycin I is the most active form of the antibiotic. We identified and inactivated the gene encoding the acetyltransferase responsible for the production of spiramycin II and III. The level of production of this mutant strain was further increased by over-expression of the regulatory gene srmR.