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Thèse soutenue

Régulation de l' épissage alternatif chez les mammifères : exemple de l' ARN pré-messager de l' acétylcholinestérase dans la physiologie musculaire

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Auteur / Autrice : Manuel Ferreira de Almeida Guerra
Direction : Claire Legay
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie. Génomes et protéines
Date : Soutenance en 2005
Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

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L' épissage alternatif des ARN prémessagers est un mécanisme important de diversification des protéines codées par un même gène chez les eucaryotes supérieurs. Je m’intéresse à l’épissage du transcrit codant l’acétylcholinestérase (AChE), une enzyme hydrolysant l’acétylcholine en acétate et choline. Celle-ci est essentielle au contrôle de la neurotransmission cholinergique notamment au niveau de la jonction neuromusculaire. Le gène de l’AChE possède 5 exons codants dont les trois situés en 5’ codent le domaine N-terminal de l’enzyme suffisant à une activité catalytique normale. L’extrémité 3’ de l’ARN prémessager contenant les exons 5 et 6 est épissée alternativement. Dans les neurones et les muscles, l’extrémité C-terminale de l’AChE est codée par l’exon 6. Cette extrémité permet en interagissant avec des protéines spécifiques, d’ancrer l’AChE sur des régions spécialisées de la lame basale ou de la membrane plasmique. Dans les cellules erythroblastiques et lymphocytaires, l’ARN prémessager de l’AChE est épissé différemment et l’extrémité C-terminale de l’enzyme est alors codée par l’exon 5. Ceci permet un ancrage diffus de l’enzyme sur la membrane plasmique par l’intermédiaire d’un GPI. Ces deux formes, musculaires et lymphocytaires, du messager et de l’enzyme sont appelées respectivement forme T (pour tailed) et forme H (pour hydrophobic). Une troisième forme, R (pour readthrough) qui serait impliquée dans la réponse au stress, est codée par un transcrit non épissé dans le domaine alternatif du prémessager. Le but de mes recherches est d’identifier les séquences en cis impliquées dans les choix d’épissage. Après avoir montré que la lignée cellulaire myogénique MBI produit majoritairement des transcrits de type T de manière endogène, j’ai mis au point les conditions d’analyse de l’épissage de transcrits recombinants dans cette lignée ainsi que dans la lignée de cellules fibroblastiques COS-7 qui ne présente pas de spécificité d’épissage et produit les trois types d’ARN messagers et de sous-unités protéiques. Les transcrits recombinants sont exprimés après transfection transitoire d’un minigène comportant les exons codant le domaine catalytique fusionnés suivis du domaine alternatif complet. L’analyse des produits d’épissage est ainsi réalisable à la fois au niveau de l’ARN (par RT-PCR) et de la protéine (par gradient de saccharose). Des mutations du minigène d’AChE transfecté dans la lignée MBI m’ont permis d’établir les résultats suivants: (i) le domaine alternatif du gène (intron 4’, exon 5, intron 5’ et exon 6) est suffisant pour un épissage normal vers la forme T; (ii) la séquence 3’ non codante en aval de l’exon 6 ne semble pas jouer de rôle dans les choix d’épissage; (iii) les séquences codantes (exons 5 et 6) n’influent pas sur les choix d’épissage; (iv) l’utilisation du site accepteur de l’intron 4’ est réprimée dans la lignée MBI; (v) des motifs particuliers des introns 4’ (triplets de guanosine) et 5’ (séquences polypyrimidiques) semblent impliqués dans le choix d’épissage. Ces résultats, qui soulignent le rôle essentiel des introns 4’ et 5’, m’amènent à formuler un premier modèle du mécanisme d’épissage alternatif du messager de l’AChE. Par ailleurs, suite à un article paru en 2002 (Meshorer E. Et al. Science 2002) remettant en cause la structure primaire des transcrits matures d’AChE, j’ai été amené à caractériser précisément celle-ci par la méthode RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Mes résultats montrent que dans les types cellulaires étudiés, la structure des ARN est conforme à celle qui était auparavant décrite.