Régulation de la prolifération cellulaire au cours de la cicatrisation cutanée : rôle de p27KIP1, un inhibiteur des Kinases Dépendantes des Cyclines

Dynamic characterization of the molecular events controlling dermal fibroblasts proliferation during wound healing : role of p27KIP1, a Cyclin-Dependent Kinase inhibitor

• Auteur / Autrice : Anne-Amandine Chassot
• Direction : Gilles Ponzio, Vjekoslav Dulic
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Nice
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cyclines

Fibroblastes

Cycle cellulaire

Cellules -- Prolifération

Cicatrisation

Résumé

La cicatrisation cutanée consiste en un programme dynamique et coordonné d'événements, dont les signaux initiateurs conduisent des cellules quiescentes, situées aux berges de la blessure, à migrer, proliférer et déposer une nouvelle matrice dans le lit de la blessure, de manière à restaurer à la peau son intégrité physique et fonctionnelle. La prolifération, en particulier celle des fibroblastes dermiques, est une étape essentielle de ce processus. Des pathologies cicatricielles comme les chéloïdes, les cicatrices hypertrophiques et les ulcères sont des exemples de désordres fibroprolifératifs et il est actuellement admis que la chronicité du processus de cicatrisation contribue à l'apparition de certains carcinomes spinocellulaires. Si la cicatrisation est bien étudiée d'un point de vue descriptif, il n'existe en revanche aucun système biologique performant permettant une étude moléculaire. Pour contourner cette difficulté, nous avons développé un système original et reproductible qui mime in vitro les différentes étapes du processus et permet la détection et la quantification des événements moléculaires associés. Mon travail de thèse a eu pour but de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine 1) de l'entrée des fibroblastes dermiques dans le cycle cellulaire en réponse à une blessure, et 2) de leur arrêt de prolifération une fois la blessure refermée. Nous décrivons pour la première fois que la blessure mécanique d'un tapis confluent de fibroblastes provoque une entrée synchrone des cellules dans le cycle cellulaire. Cette entrée en cycle s'accompagne d'une diminution de l'ARN messager de p27, un inhibiteur de l'activité des cyclines-dépendantes kinases qui joue un rôle clef dans le contrôle de la prolifération cellulaire, et de la stimulation de l'expression d'Id3, un gène de réponse précoce codant un inhibiteur de l'activité transcriptionnelle des facteurs de type bHLH. Grâce à une approche siRNA, nous démontrons qu'Id3 contrôle la diminution de p27, permettant l'entrée en cycle et la division cellulaire. Lorsque la lésion est comblée, la prolifération cellulaire s'arrête et les cellules entrent dans une nouvelle phase de quiescence. Nous avons démontré que cette sortie de cycle est précédée i) d'une stabilisation pré-mitotique de l'inhibiteur p27, ii) de son association avec les complexes cycline A-Cdk1/2 et cycline D1-Cdk4/6, iii) d'une diminution de la phosphorylation des '' pocket '' protéines pRb et p130. En revanche, p27 ne s'associe pas avec les complexes cycline B1-Cdk1 et n'inhibe pas leur activité enzymatique. Les fibroblastes dermiques entrent donc en mitose puis sortent du cycle de manière réversible dans la phase G1 suivante. La réduction du niveau d'expression de p27 par une approche siRNA réverse partiellement ce phénotype. En conclusion, notre travail démontre pour la première fois dans le contexte physiologique de la cicatrisation cutanée, que p27 est l'élément clef qui contrôle à la fois l'entrée des cellules en cycle et leur sortie en fin de cicatrisation, et qu'il est un médiateur de signaux antiprolifératifs agissant après le point de restriction et avant la mitose.

Skin wound healing is a complex phenomenon that involves multiple cellular processes (migration, proliferation, differenciation. . . ) and cell types allowing the reconstruction of skin lesions. Many genetic or acquired defects can perturb the normal wound healing process, leading to skin pathologies like hypertrophic scars, keloïds or ulcers, in which fibroblasts are characterised by an abnormal proliferation. However, the molecular abnormalities at the origin of these pathologies are still unknown notably because the classical experimental systems do not allow a molecular approach of the process. To circumvent this hurdle, we have developed an original device that performs calibrated injuries and enables the detection of a wide range of molecular events activated during wound healing. Using this experimental system, we show that mechanical lesions performed within confluent human dermal fibroblasts provoke a synchronous cell cycle entry followed by a cell cycle exit after mitosis. We demonstrate that the mRNA of p27Kip1, a cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor which plays a key role in negative control of cell proliferation, is transiently downregulated after injury. We identify Id3, a bHLH transcriptional repressor, as a candidate for p27 down regulation. Id3-siRNA reversed the injury–mediated p27 down-regulation and blocks the cell cycle progression, demonstrating that Id3 is involved in the transcriptional repression of p27 and that this early regulation is required for cell proliferation. When cells reach confluence, the cell cycle exit is preceded by pre-mitotic stabilization of p27 and association with cyclin A-Cdk1/2 and cyclin D1-Cdk4/6 (but not cyclin B1-Cdk1) complexes, and decreased pocket protein phosphorylation. Reduction of p27 by siRNA partially reverses this phenotype, supporting a role for p27 as a mediator of anti-proliferative cues occurring after the restriction point.