Etude des mécanismes moléculaires de la différenciation mélanocytaire induite par l'AMPc : rôle de la voie de la P13-K et du facteur de transcription MITF

• Auteur / Autrice : Mehdi Khaled
• Direction : Corine Bertolotto
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Nice
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Différenciation cellulaire

Mélanocytes

Résumé

La synthèse des pigments mélaniques, principal paramètre de la différenciation mélanocytaire joue un rôle clé dans la protection contre les effets délétères des rayons UV. De nombreuses observations cliniques et données expérimentales montrent le rôle clé des hormones mélanotropes, notamment aMSH et ACTH, dans la différenciation mélanocytaire. Ces hormones agissent sur les mélanocytes en induisant une augmentation du taux intracellulaire en AMPc. Il a été montré dans les mélanomes de souris B16, que l’AMPc conduit à l’inhibition de la voie de la PI3-K et que l’inhibition de cette voie stimule fortement la mélanogenèse. Mais les mécanismes moléculaires mis en jeu dans ce processus, restaient a être détaillés. C’est pourquoi, au cours de ma thèse j’ai cherché à comprendre comment l’inhibition de la PI3-K régule la différenciation mélanocytaire. Dans un premier temps, nous avons montré dans les mélanomes de souris B16, que l’AMPc inhibe l’activité de la protéine kinase B PKB/AKT, la principale cible intracellulaire de la PI3-K, et conduit en aval à l’activation de GSK3b. De plus, nous avons observé que le lithium, un inhibiteur de GSK3b inhibe la réponse à l’AMPc du promoteur de la tyrosinase et que GSK3b synergise avec MITF pour stimuler la transcription de la tyrosinase. Enfin, nous avons mis en évidence que l’AMPc augmente la liaison de MITF sur sa séquence cible. En accord avec les données de la littérature, ces observations nous ont permis de proposer l’hypothèse selon laquelle l’activation de GSK3b par l’AMPc, conduit à la phosphorylation de MITF sur la sérine 298. Cette phosphorylation stimule la liaison de MITF sur sa séquence cible dans le promoteur de la tyrosinase, et favorise la transcription de l’enzyme et ainsi stimule la mélanogenèse. Deuxièmement, nous avons montré que l’inhibition de la PI3-K par un inhibiteur pharmacologique le LY294002 induit une augmentation d’expression des enzymes de la mélanogenèse : tyrosinase et tyrp1, via un mécanisme transcriptionnel qui nécessite le facteur de transcription MITF. En effet, le LY294002 induit une augmentation de la transcription de MITF, et un mutant dominant négatif de MITF ne permet plus la stimulation de l’expression des enzymes de la mélanogenèse induite lors de l’inhibition de la voie de la PI3-K. En conclusion, nous avons montré que l’inhibition de la voie de la PI3-K agit à deux niveaux dans la régulation de la mélanogenèse: d’une part, elle augmente l’expression de MITF et d’autre part elle augmente sa fixation à sa séquence cible dans le promoteur de la tyrosinase. Notre travail permet donc de mieux comprendre comment la voie de la PI3-K, en convergeant vers MITF, est impliquée dans la régulation de la différenciation mélanocytaire.

The synthesis of the melanin pigments, the principal parameter of melanocytic differentiation, plays a key role in protection against deleterious effects of UV. Multiple clinical observations and experimental data show the key functionof the melanotropic hormones act on the melanocytes by inducing an increase in the intracellular cAMP concentration. In B16 mouse melanoma cells it was shown that cAMP leads to the inhibition of the PI3-K pathway and that this inhibition strongly stimulates the melanogenesis. But the molecular mechanisms involved in this process, however, remain to be elucidated. The focus of my thesis has been to try to understand how the inhibition of PI3-K controls melanocyte differentiation. Initially, we showed in the B16 melanoma cells that cAMP inhibits the activity of the protein kinase B PKB/AKT, the principal intracellular target of PI3-K, and leads to the downstream activation of GSK3b. Moreover, we observed that lithium, an inhibitor of GSK3b, inhibits the response to cAMP on tyrosinase promoter and that GSK3b synergises with MITF to stimulate the transcription of tyrosinase. Lastly, we demonstrated that cAMP increases the binding of MITF on its target sequence. In accordance with literature studies, these observations enabled us to propose that the activation of GSK3b by cAMP leads to MITF phosphorylation on serine 298. This phosphorylation stimulates the binding of MITF to its target sequence in the tyrosinase promoter, increases the transcription of the enzyme, and thus, stimulates the melanogenesis. In the second part of my studies, using a pharmacological inhibitor of the PI3-K, LY294002 we showed that the inhibition of the PI3-K induces an increase in the expression of two melanocytic enzymes tyrosinase and tyrp1 by a transcriptional mechanism which requires the transcription factor MITF. While LY294002 treatment induced an increase in MITF transcription, a dominant negative mutant of MITF did not allow any further stimulation in the expression of the melanocytic enzymes typically induced by the inhibition of the PI3-K pathway. In conclusion, we showed that the inhibition PI3-K pathway acts on two levels in the melanogenesis regulation. On one hand, it increases the MITF expression, and on the other hand, it increases binding on its target sequence to the tyrosinase promoter. Our work allows for better understanding of how the action of MITF in the PI3K pathway is implicated in the regulation of melanocyte differentiation.