Etude des mécanismes de régulation de l'épissage des ARN de deux rétrovirus, le virus du Sarcome de Rous (RSV) et le virus responsable de l'immunodéficience humaine (VIH-1)

Pre-mRNA splicing regulation of two retroviruses, Rous Sarcoma virus (RSV) and Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1)

• Auteur / Autrice : Virginie Marchand
• Direction : Christiane Branlant
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Nancy 1
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et techniques

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plasmides

Chromatographie d'affinité

VIH (virus)

Épissage (génétique)

ARN messagers

Résumé

L'épissage est une étape majeure dans le cycle de multiplication du virus VIH-1. Un seul transcrit permet la production d'une quarantaine d'ARNm différents par l'utilisation combinée de 4 sites 5' et 8 sites 3' d'épissage. Nous avons établit la structure secondaire de la région autour d'un site 3' (A7) et mis en évidence un nouvel élément régulateur alternatif Janus qui fixe les protéines hnRNP A1 ou les protéines SR ASF/SF2. Nous avons montré que l'épissage au site A7 est régulé par les protéines SR ASF/SF2, 9G8 et hnRNP A1. Par ailleurs, nous avons développé une approche de protéomique basée sur une chromatographie d'affinité couplée à une électrophorèse mono ou bi-dimensionnel suivie d'une analyse par spectrométrie de masse qui a permis l'identification de nouvelles protéines capables d'interagir avec un ARN contenant le site A7 et l'élément Janus. Enfin, nous avons créé un plasmide avec deux gènes rapporteurs luciférases permettant de quantifier l'épissage des ARN pré-messagers dans les cellules de mammifères. En parallèle, nous avons établit la structure secondaire de l'élément NRS du virus du Sarcome de Rous et identifié les sites de fixation des protéines SR (SC35, SRp40 et ASF/SF2) et hnRNP A1.

Pre-mRNA splicing is a key step for HIV-1 multiplication. Four donor and eight acceptor sites are used in combination to produce 40 different mRNA. We established the RNA secondary structure around the A7 3' acceptor site and discovered a new regulatory cis acting sequence called Janus element that binds either hnRNP A1 or ASF/SF2 proteins. Moreover, the A7 splicing site is regulated by ASF/SF2, 9G8 and hnRNP A1. We used a proteomic approach based on an affinity chromatography coupled with 1 or 2D gel electrophoresis and mass spectrometry. By this approach, we identified new proteins which can interact with an RNA containing A7 3' acceptor site and the Janus element. Finally, we developed a dual luciferase reporter plasmid that can measure the pre-mRNA splicing efficiency in mammalian cells. In parallel, we established RNA secondary structure of the NRS element of the Rous sarcoma virus and identified the binding sites for SR proteins (9G8, SRp40 and ASF/SF2) and hnRNP A1.