Etude des protéines de salives

par Virginie Jan

Thèse de doctorat en Toxinologie, génomique fonctionnelle

Sous la direction de Valérie Choumet.

Soutenue en 2005

à Paris, Muséum national d'histoire naturelle , dans le cadre de École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris) .

mots clés

• Vipère aspic -- Venin -- Europe
• Animaux -- Toxicologie -- Europe
• Anopheles gambiae
• Paludisme
• Protéines salivaires

Résumé

1) Evolution des phospholipases A2 (PLA2) de venin de vipères européennes et implications dans la toxicité du venin : Notre étude a pour base la mise en évidence d’une population de vipères « aspic » au venin neurotoxique dans deux départements du sud-est de la France. Nous avons mené une étude du transcriptome des PLA2 du venin de ces vipères. Nous avons pu montrer que l’évolution de la toxicité de leur venin est due à l’expression simultanée des gènes de 2 neurotoxines, l’ammodytoxine (Atx) et la vaspine. L’Atx aurait été acquise par des flux de gènes suite à des événements d’hybridation et d’introgression, alors que la vaspine résulte de l’expression de deux gènes ancestraux. La diversité des PLA2 des venins de 9 sous-espèces de Vipera a été comparée afin de déterminer l’origine de cette population neurotoxique. L ensemble des variations observées au niveau du transcriptome des PLA2, résulte des mécanismes de régulation d’expression de gènes et la perte de copies de gènes. Nos études ont permis de montrer l’importance des évènements de recombinaison dans l’évolution de la famille multigénique des PLA2 de venin de vipères. Ces évènements induisent des remaniements génomiques à l’origine d’une perte de variabilité par la perte de gènes complets ou par la formation de pseudogènes ou à l’inverse participent à l’expansion de la famille multigénique dans le génome. Ils permettent aussi de générer des PLA2 hybrides dont les fonctions pourraient être recrutées par l’évolution. La considération de ces remaniements génomiques augmente la complexité de l’étude de cette famille multigénique, car ils constituent une source de variabilité ayant conduit à la fixation de nouveaux isoformes (les AmI1 et I2 par exemple). L’identification des forces évolutives impliquées dans l’évolution des PLA2 et de leurs isoformes est rendue particulièrement délicate en raison de la nécessité de différencier les gènes paralogues des gènes orthologues, surtout lorsque le signal évolutif est brouillé par des remaniements génomiques. 2) Propriétés pharmacologiques de la salive d’Anopheles gambiae et potentiel vectoriel dans le paludisme : Les propriétés pharmacologiques des extraits de glandes salivaires (EGS) d’Anopheles gambiae ont été caractérisées après fractionnement par filtration moléculaire. Ils contiennent un ensemble de composés actifs à plusieurs niveaux de la cascade de la coagulation. Le mélange agit de façon synergique, en induisant un retard du temps de coagulation, qui permet au moustique d’effectuer son repas sanguin. L’étude de ces activités a été menée pour la première fois sur l’ensemble des fractions d’EGS et les résultats nous ont permis de mettre en évidence la très grande complexité d’interaction entre des composés pro et anticoagulants. Les EGS d’Anopheles gambiae contiennent des composés inhibiteurs des « facteurs actifs » tels que : la kallikréine, le FXa, la thrombine la protéine Ca, l’urokinase et la plasmine. Au contraire, les formes inactives des facteurs de la coagulation, les zymogènes tels que le plasminogène ou la prothrombine, sont clivées. L’activité procoagulante résulte de l’inhibition du rétrocontrôle par la protéine Ca. Les extraits de glandes salivaires de moustiques varient dans leur composition selon l'âge du moustique, selon qu'il ait pris un repas sanguin et selon qu’il soit infecté par Plasmodium berghei. Les EGS de moustiques infectés sont caractérisés par une modification de leur composition et de leurs activités pharmacologiques. L’ensemble des résultats tend à montrer que les EGS de moustiques infectés présentent des profils d’activité similaires à ceux des moustiques non gorgés. Quelques modifications observées sur la régulation de la cascade de coagulation assurée par la voie de la protéine Ca et l’absence de l’inhibiteur de thrombine spécifique des moustiques âgés de 21 jours suggèrent que la salive des moustiques infectés est potentiellement moins efficace pour contrer le processus de coagulation de l’hôte. Cette perte d’efficacité pourrait s’accompagner d’une nécessité à piquer plusieurs hôtes, donc d'augmenter le potentiel vectoriel du moustique.

Titre traduit

Saliva proteins analysis

Résumé

1) Evolution from European viper venom phospholipase A2 (PLA2) and venom toxicity: Our study is based on the description of a population of Vipera aspis aspis in the southeast of France, whose venom is unusually neurotoxic. We have undertaken an analysis of the venom PLA2 content of this population at the transcriptome level. Our results have shown that the evolution of the toxicity of the venom results from the simultaneous expression of two neurototoxins encoding genes. , i. E. , ammodytoxin (Atx) and vaspin. Atx has been acquired thanks to gene flew following hybridation and introgression events whereas vaspin results from the expression of two ancestral genes. The venom PLA2 diversity from 9 Vipera subspecies has been analysed in order to define the source of this neurotoxic population. All the variations observed on the PLA2 transcriptome result from regulation of gene expression and loss of gene copies. Our studies underlined the importance of recombination events in the evolution of venom PLA2 multigenic familly. We showed that genomic reorganisation induced a decrease in the PLA2 diversity through loss of complete gene copies or pseudogene formation. Conversely, it also induced an increase in the diversity through crossing over that may participate to the expansion of the multigenic familly. Recombination events also generate hybrid PLA2 from which novel functions may be recruited by evolution. Genomic reorganisation have moreover been observed as source of variability leading to the fixation of novel PLA2 isoforms (i. E. , AmI1 and AmI2). Identification of the driving forces implied in the PLA2 evolution is therefore particularly subtile because of the need to distinguish between orthologous from paralogous genes and especially when genomic reorganisation mix the evolutive signal. 2) Pharmacological properties of Anopheles gambiae saliva ans vectorial potential of malaria. Pharmacological activities of Anopheles gambiae salivary gland extracts (SGE) have been characterized following fractionation of its various components by gel filtration. They contain an arsenal of active compounds on blood coagulation. The mixture acts synergetically inducing delay in the coagulation time. This allows blood feeding of mosquitoes. Pharmacological screenings have been performed on fractionnated SGE. The results made evidence of the complexity of interaction of the procoagulant and anticoagulant compounds. A. Gambiae SGE contain inhibitors of “active factors” such as kallikrein, Fxa, thrombine, protein Ca, urokinase and plasmine. On the opposite, the inactive forms of blood coagulation factors, the corresponding zymogens, ‘i. E. , plasminogen or prothrombin, are clived. We found that procoagulant activity results from the inhibition of retrocontrol pathway mediated by protein Ca, therefore explaining the tendancy to increase fibrinoformation and procoagulant activity. The composition of SGE vary as a function of the age of the mosquitoes, the blood feding and the infection by Plasmodium berghei. SGE from infected mosquitoes differ in their composition and their pharmacological activity. The observed modifications either imply the maintain or the reactivation of some typical activities of non blood-fed mosquitoes SGE. All the results converge in showing the similarity between the SGE patterns of non blood-fed mosquitoes and infected mosquitoes. Some variability has however been observed on the protein Ca regulation pathway and on the absence of thrombin inhibitor, specific to the 21 days old healthy mosquitoes. Thus, the infected mosquito saliva is potentially less efficient to counteract the hemostasis system of the host regulation of the coagulation cascade. This decrease may be coherent with the increase in probing events already mentioned in the litterature.