Développement de nouvelles méthodes analytiques et bioanalytiques pour la détermination des composés oestrogéniques dans les matrices complexes

par Pierre Andrieux

Thèse de doctorat en Chimie bioanalytique

Sous la direction de Marie-Claire Hennion.

Soutenue en 2005

à Paris, Muséum national d'histoire naturelle , dans le cadre de École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris) .

Le président du jury était Max Goyffon.

Le jury était composé de Marie-Claire Hennion, Eric Thybaud, Bernard Bodo, Patrick Balaguer.

Les rapporteurs étaient Jacques Crommen, Bertold Hock.

mots clés

• Estrogènes -- Analyse
• Hormones femelles -- Métabolisme
• Endocrinologie moléculaire -- Analyse

Résumé

L'émergence de la problématique des perturbateurs endocriniens a conduit à évaluer l'exposition de l'homme et de la faune à de faibles doses des ces composés, en particulier les composés oestrogéniques. Cependant les faibles concentrations et la diversité structurale des composés actifs constituent une limitation importante pour leur analyse chimique dans des matrices complexes. Face au manque de sélectivité de l'extraction sur phase solide avec des adsorbants classiques ainsi qu'au champ d'application de l'immuno-extraction limité aux composés de structure proche, une nouvelle approche a été développée. Les récepteurs aux oestrogènes (RE), cibles endogènes des composés oestrogéniques, ont été utilisés pour l'extraction de ces composés reliée à leur mode d'action commun. Un RE recombinant a été produit dans des bactéries et différentes approches ont été étudiées pour leur immobilisation sur support solide. Le greffage covalent sur silice et les différents paramètres clés de la chromatographie d'affinité ont été optimisés, permettant l'extraction sélective de différents composés oestrogéniques. L'utilisation de cet adsorbant couplé en ligne avec la micro chromatographie en phase liquide avec une détection par spectrométrie de masse (µCPL-SM) améliore la sensibilité et la fiabilité de l'analyse, en particulier dans les matrices complexes. Cette méthode a ainsi été utilisée avec succès pour l'analyse environnementale des composés oestrogéniques. La chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés a été évaluée comme une approche différente pour l'immobilisation non covalente des récepteurs sur une phase solide, ce qui permet une préparation aisée et rapide des supports d`extraction. Une nouvelle stratégie pour le couplage en ligne avec la CPL-SM a été développée puis utilisée pour l'extraction sélective et l'analyse de composés naturels oestrogéniques présents dans les aliments.

Résumé

Growing concerns about endocrine disrupting chemicals have led to the evaluation of low levels exposure of humans and wildlife to these chemicals, especially for estrogenic compounds. However, the very low concentrations and the structural diversity of active chemicals constitute important drawbacks for their analytical determination in complex matrices. In order to overcome the lack of selectivity of classical solid-phase extraction sorbents and the limited scope of structurally related chemicals extraction with antibody-based sorbents, a new approach was developed. Endogenous targets of estrogenic compounds, the estrogens receptors (ERs) were used for the bio-effect related extraction of these chemicals. Recombinant ER was produced in bacteria and different approaches for its immobilization on solid-support were studied. The covalent coupling to silica and key parameters of a receptor-affinity extraction were optimized, thus allowing the selective extraction of a wide range of estrogenic compounds. The on-line coupling of the ER-based extraction to liquid micro chromatography-mass spectrometry (µLC-MS) improved sensitivity and reliability of analytical determinations of target chemicals, especially in complex matrices. This method was then successfully used for environmental monitoring of estrogenic compounds. Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography was investigated as another approach for the ER immobilization, allowing thus a more rapid preparation of the receptor-based extraction sorbents. A new strategy was developed in order to on-line couple this solid-phase to LC-MS, and was used for the selective extraction and determination of naturally occurring estrogenic compounds in food.