Structural analysis of Pseudomonas aeruginosa serogroup O5 lipopolysaccharides

par Gilles Bedoux

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Karine Vallée Réhel et de Dominique Haras.

Soutenue en 2005

à Lorient .

  • Titre traduit

    Analyse structurale du lipopolysaccharide de Pseudomonas aeruginosa serogroup O5


  • Résumé

    Au cours de la formation d'un biofilm, Pseudomonas aeruginosa exprime divers phénotypes. Lors de ce travail, nous avons étudié la structure du lipopolysaccharide (LPS) lorsque P. Aeruginosa croît en biofilm. Le LPS est ancré dans la paroi bactérienne par l'intermédiaire d'une partie lipidique appelée lipide A. Une partie polyosidique constituée d'un noyau (oligosaccharide) et d'une partie antigénique (antigène O) complète la structure du LPS. P. Aeruginosa PAO1 et les mutants algC et PDO100 ont été cultivés en suspension et en biofilm. Une méthode d'isolement du LPS a été développée, permettant son analyse biochimique et chimique. L'analyse électrophorétique sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) des LPS du mutant algC a permis d'observer une variation du profile dans la région des hautes masses moléculaires pour une croissance des cellules en biofilm pendant 24 ou 48 heures. L'analyse partielle de la composition des LPS a montré que la teneur en phosphate décroît sensiblement lorsque P. Aeruginosa PAO1 et le mutant PDO100 sont cultivés en biofilm. Un traitement du LPS par hydrolyse douce a été réalisé dans le but d'analyser séparément le lipide A, le noyau et l'antigen-O. A l'aide de la spectrométrie de masse associant une source à ionisation par électrospray (ESI-MS) et une trappe ionique, quelque soit le mode de croissance – en suspension ou en biofilm – le spectre de masse du lipide A de P. Aeruginosa PAO1 a révélé des dérivés tétra , penta et hexa acylés. Un dérivé hexa acylé contenant une chaîne hexadecanoyl (C16:0) a été détecté pour la première fois par ESI-MS. La chaîne C16:0 est liée à la chaîne décanoyl greffée en position C-3' au corps diglucosamine du lipide A. Le substituant L 4-ArapN ou un groupement pyrophosphate sont liés en position C-4' au corps du lipide A. L'analyse de la composition du noyau des LPS de P. Aeruginosa PAO1 et du mutant algC a montré la présence de deux résidus d'acide 3 deoxy-D manno-octulosonique (Kdo), deux résidus L glycero-D manno-heptose (Hep) et un résidu de N-(L alanyl)-D galactosamine. La présence et la position d'un groupement diphosphate éthanolamine (PPEtN) ont été déterminées par RMN 2D et par spectrométrie de masse au sein du noyau du LPS du mutant algC. En outre, la structure du noyau complet du LPS de P. Aeruginosa PAO1 a été réexaminée et la distribution des sites de phosphorylation révisée.


  • Résumé

    In the course of biofilm formation, Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes. In this work, we investigated the lipopolysaccharide (LPS) structure when P. Aeruginosa was grown as biofilm. LPS is anchored in the bacterial wall by a lipid part called lipid A. A polyosidic part composed of the core oligosaccharide and the O-antigen (or O-polysaccharide) caps the LPS. The wild type strain P. Aeruginosa PAO1, and the mutant strains algC and PDO100 were grown planktonically and as biofilm. A rapid LPS isolation procedure was developed allowing its biochemical and chemical characterisation. The sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of the algC LPS revealed a variation of the electrophoretic profile in the high molecular weight region when cells were grown as biofilm for 24 or 48 hours. The LPS samples were also submitted to partial composition analysis. The phosphate content appeared to be lower when the wild type strain P. Aeruginosa PAO1 and the rhlI mutant strain PDO100 were grown as biofilm. A mild hydrolysis of LPS was performed in order to analyse separately the lipid A, the core and the O-polysaccharide. Using electrospray ionisation mass spectrometry (ESI-MS) coupled with ion-trap fragmentation techniques, and no matter what mode of growth - planktonic or biofilm - the lipid A ESI-mass spectrum of the wild type strain P. Aeruginosa PAO1 revealed known tetra , penta , and hexa acylated structures. An additional hexaacylated lipid A containing a hexadecanoyl chain (C16:0) was detected for the first time by ESI-MS. The position of the C16:0 chain O-linked to the decanoyl chain at C-3' position of the diglucosamine lipid A backbone was determined. The L 4-ArapN group or a pyrophosphate group were shown to be linked at the C-4' position of the lipid A backbone. The compositional analysis of the LPS core isolated from P. Aeruginosa PAO1 and the algC mutant showed two residues each of 3 deoxy-D manno-octulosonic acid (Kdo) and L glycero-D manno-heptose (Hep), one residue of N-(L alanyl)-D galactosamine. The presence and the position of an ethanolamine diphosphate group (PPEtN) was elucidated using 2D NMR spectroscopy and mass spectrometry in the core of algC mutant. In addition, the structure of the complete LPS core of wild-type strain P. Aeruginosa PAO1 was reinvestigated and the distribution of the phosphorylation sites was revised.

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  • Détails : 1 vol. (121 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 95-121

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