Recherche Avancée

Thèse soutenue

L'ochratoxine A, contaminant alimentaire, est-elle un cancérogène génotoxique ou épigénétique? : recherche des effets génotoxiques par la technique de post-marquage de l'ADN au 32P en relation avec la métabolisation de l'ochratoxine A

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Auteur / Autrice : Virginie Faucet-Marquis
Direction : Annie Pfohl-Leszkowicz
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Qualité et sécurité des aliments
Date : Soutenance en 2005
Etablissement(s) : Toulouse, INPT

Résumé

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''L'ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine néphrotoxique, produite par plusieurs espèces de champignons, des genres Aspergillus et Penicillium, se développant en particulier sur les denrées alimentaires au cours de leur stockage. L'exposition de l'homme à cette toxine se fait via la chaîne alimentaire aussi bien par les produits végétaux que par la viande. Chez les animaux, elle est clairement cancérogène au niveau du rein, chez l'homme elle a été classée par le CIRC en 1993 (Centre international de la recherche sur le cancer) comme ''potentiellement cancérogène pour l'homme'' (groupe 2B). Le mécanisme par lequel cette toxine induit des cancers n'est pas totalement élucidé et fait l'objet de débats. En effet, il reste à déterminer si c'est un cancérogène génotoxique (via une liaison covalente sur l'ADN) ou un cancérogène épigénétique (non génotoxique, via un stress oxydatif par exemple). Le but de notre travail est de clarifier le mécanisme d'action de cette toxine, en identifiant la nature exacte des adduits à l'ADN formés ainsi que les métabolites responsables de l'induction de cancer des voies urinaires. Le post-marquage de l'ADN au 32P est une méthode très sensible de détection des adduits à l'ADN. Lors d'analyses d'ADN de rats, post-marqués au 32P en co-chromatographie avec des adduits standard OTA-Guanine, nous avons montré que des adduits covalents de l'OTA sur l'ADN étaient formés in vivo. D'autre part, l'administration d'OTA à des souris gestantes a induit la formation d'un adduit sur l'ADN testiculaire et rénal de leur progéniture. Cet adduit est chromatographiquement identique au standard C-C8 OTA-dG. D'autre part, nous avons montré que le dérivé OTHQ induisait la formation d'adduits à l'ADN sans activation métabolique supplémentaire et similaires à ceux observés avec l'OTA; l'OTHQ est donc un métabolite réactif de l'OTA. L'analyse de la biotransformation de l'OTA par différents systèmes de métabolisation a permis de mettre en évidence la métabolisation de l'OTA en divers métabolites. Au moins 23 dérivés différents ont été formés lors d'incubations de microsomes de porc (foie et rein). Certains ont été identifiés (OTB, 4R, 4S-OHOA, OP-OA, Otα). Nous avons mis en évidence, par spectrométrie de masse, la formation d'un dérivé déchloriné de l'OTA (différent de l'OTB) de masse 366g/mol. D'autres restent encore de nature inconnue. Nous avons montré que la métabolisation était spécifique du sexe, de l'organe et de l'espèce de l'animal. De plus, la modulation de la biotransformation de l'OTA par les composés buthionine sulfoximine, acivicine et mélatonine a orienté fortement le métabolisme de l'OTA vers la production, respectivement, d'un dérivé déchloriné de l'OTA, de l'OTB et de l'OP-OA. Ces expériences corrélées avec l'étude des adduits à l'ADN nous ont permis de montrer que l'OTA est un cancérogène génotoxique qui nécessite d'être biotransformé pour exercer ses effets sur l'ADN; la lipoxygénase est impliquée dans cette activation métabolique. ABSTRACT : Ochratoxin A (OTA) is a nephrotoxic mycotoxin, produced by several molds of the Aspergillus and Penicillium species which may contaminate foodstuffs mainly during storage. Humans are exposed to this toxin via the food chain, by ingestion of plants or meat. OTA induced kidney cancer in rodent, and has been classified by International agency on Cancer Research (IARC) in 1998 as ''possible human carcinogen'' (group 2B). OTA carcinogenic mechanism is still under debate. Does OTA act as a genotoxic carcinogen (by direct covalent binding on DNA) or as an epigenetic carcinogen (no genotoxic, oxidative stress by example)? The overall goal of this work was to determine the nature of DNA adducts and their relation to metabolic fate. Thus, the existence of the “true” adducts responsible for the induction of urothelial tract tumors should be ascertained. Covalent DNA adducts have been detected by the sensitive method of 32P-postlabelling of DNA. By commigration of authentic OTA-Guanine adduct postlabelled with DNA adducts from rat or pig kidney DNA, it was demonstrated that covalent adducts are formed in vivo. In addition, exposure of pregnant mice to OTA has induced OTA-DNA adduct formation in kidney and testis of newborn mice. One adduct formed in both organs exhibited the same chromatographic properties as C-C8 dG OTA standard. OTHQ (quinone form of OTA) induced direct DNA adduct without metabolic activation. Some adduct induced by OTHQ are similar to OTA DNA adducts. Thus OTHQ is one of the OTA derivatives implicated in the genotoxic activity of OTA. Use of several models (cell cultures, in vitro incubation with microsomes of pig's liver or kidney. . . ) led to the formation of at least 23 OTA derivatives, including OTB, 4R, 4S-OHOTA, OP-OTA, OTα. By mass spectrometry, a dechlorinated OTA derivative (not similar to OTB) was detected, having a mass of 366g/mol. Some other derivatives of unknown structure have been isolated in the chromatographic system used. Biotransformation of OTA depends of species, gender and organs of animal. Modulation of metabolic pathway by buthionin sulfoximine, acivicin or melatonin increases the formation of large amount of dechlorinated OTA, OTB or OP-OTA respectively. These studies indicated that OTA, after metabolic activation via lipoxygenase pathway, forms covalent DNA adducts and acts as a genotoxic carcinogen. ''