Caractérisation moléculaire des sites de liaison des benzodiazépines et des bloquants du canal sur le récepteur GABAa

Molecular characterization of benzodiazepines and channel blockers binding sites of the GABAa receptor

• Auteur / Autrice : Anne Gonthier
• Direction : Maurice Goeldner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie bio-organique
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Benzodiazépines

Structure moléculaire

GABA

Récepteurs cellulaires

Résumé

Ces travaux de thèse concernent le récepteur GABA de type A, le plus important des récepteurs GABA. Ce récepteur est un complexe protéique membranaire formant un canal sélectivement perméable aux ions chlorure. Outre le site du GABA, il possède un site de liaison des benzodiazépines, avec lequel interagissent aussi des familles de molécules de squelettes chimiques différents comme les flavones, ainsi qu'un site de liaison des bloquants non compétitifs (BNC), cible d'insecticides. En l'absence de structure aux rayons X du récepteur GABAA, la connaissance exacte de ses sites de liaison reste inconnue : l'objectif de nos travaux est de caractériser la structure moléculaire du site des benzodiazépines et du site des bloquants du canal, en identifiant les acides aminés intervenant dans l'interaction de ces ligands avec le récepteur. Pour cela nous appliquerons une méthodologie originale, qui combine marquage d'affinité et mutagenèse dirigée. Nous avons synthétisé des marqueurs d'affinité, dérivés électrophiles de la thujone pour le site des BNC, de benzodiazépines et de flavones pour le site des benzodiazépines. Un dérivé du nitrazépam a été utilisé avec succès dans le cadre de la méthodologie : il a permis la détermination d'un premier point d'ancrage des benzodiazépines dans leur site. Ce marqueur d'affinité a en effet formé une liaison covalente avec le résidu en position 101 de la sous-unité alpha1 de rat, confirmant son implication directe dans l'interaction des benzodiazépines avec leur site. L'application de la méthodologie avec plusieurs marqueurs permettra d'orienter le squelette benzodiazépine dans son site. La confirmation expérimentale de l'orientation des ligands dans ce site permet de valider et d'améliorer le modèle tridimensionnel qui sert d'hypothèse de travail. En utilisant des ligands structuralement différents, un pharmacophore, dénominateur commun de l'ensemble des squelettes superposés, pourra ainsi être défini de façon fiable pour le site étudié.

The GABAA receptors are the major inhibitory neurotransmitter receptors in the mammalian brain. These ligand-gated chloride channels are heteromeric transmembrane proteins with receptor sites for agonists (GABA), allosteric modulators (benzodiazepines) and channel blockers (NCB site). Since no crystal structure is available so far for these binding sites, we have applied a strategy combining site-directed mutagenesis and affinity labeling in order to determine the binding-site lining residues which interact with the ligands. For this purpose, we have synthesized reactive derivatives of alpha-thujone (NCB site ligand), benzodiazepines and flavones (ligands of the benzodiazepine site). A reactive derivative of nitrazepam reacts selectively with the cysteine mutant in position 101 of the alpha1 subunit (rat) in a time and concentration dependant way; this reaction is fully protected by reversible ligands. This confirms the involvment of residue 101 in the interaction with the benzodiazepine ligands. Using these results and forthcoming data from our ligands, benzodiazepine ligands would be positionned unambiguously in their site, as well as structurally different ligands, thus defining a reliable pharmacophore for the benzodiazepine site.