Implication de la GTPase Efl1 dans une étape de maturation cytoplasmique des sous-unités 60S de levure

Implication of the GTPase Efl1 in a cytoplasmic maturation step of 60S subunits in yeast

• Auteur / Autrice : Jean-Sébastien Graindorge
• Direction : Franco Fasiolo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

GTPases

Cytoplasme

Ribosomes

Origine de la vie

Résumé

La biogenèse des ribosomes est un processus complexe qui a lieu principalement dans le noyau mais aussi dans le cytoplasme. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'élucider la fonction de Efl1, une GTPase cytoplasmique putative homologue de EF-2 et impliquée dans la biogenèse de la sous-unité 60S. En effet la délétion de EFL1 conduit à une baisse des sous-unités 60S corrélée à des défauts de maturation des ARNr 25S et 5. 8S. D'autre part, une simple mutation ponctuelle du gène TIF6 codant pour un facteur d'assemblage de la sous-unité 60S est capable de compenser l'absence de EFL1. La déplétion de Tif6 provoque les mêmes phénotypes moléculaires que la délétion de EFL1. De plus si Tif6 est normalement localisée dans le nucléole, elle est relocalisée à 50% dans le cytoplasme dans une souche Defl1. L'ensemble de ces données nous a permis d'élaborer un modèle selon lequel Efl1 permet, au cours d'une étape de maturation cytoplasmique des sous-unités 60S, la libération de Tif6 des pré-particules 60S et son recyclage vers le noyau. Ce modèle est étayé par un test in vitro montrant la libération de Tif6 des particules 60S en présence de Efl1. Nous avons aussi pu montrer in vitro que Efl1 est bien une GTPase et que son activité est liée au centre GTPasique des ribosomes. En supposant que Efl1 puisse servir de moteur moléculaire pour permettre des réarrangements structuraux, nous avons sondé le centre GTPasique de particules issues de souches sauvage, révertante et Defl1. Cependant les seules modifications conformationnelles observées dans l'ARNr semblent être liées à un déficit nucléolaire de Tif6 au cours de la biogenèse. Par ailleurs l'analyse par spectrométrie de masse des constituants présents dans les pré-particules 60S issues des trois souches différentes montre qu'aucun facteur d'assemblage ne semble être déficitaire dans une souche Defl1.

Ribosomal biogenesis is a complex process that occurs principally in the nucleus but also in the cytoplasm. Works present in this thesis had the elucidation of Efl1 function as an object. Efl1, an homologue of EF-2, is a putative cytoplasmic GTPase implied in 60S subunit biogenesis. EFL1 deletion leads to 60S subunits decrease and defaults in 25S and 5. 8S rRNA processing. On the other hand, a single mutation on TIF6, which codes for a 60S subunit assembling factor, is able to compensate for EFL1 deletion. Tif6 depletion and EFL1 deletion present similar molecular phenotypes. Furthermore Tif6, which is localized in the nucleolus in wild-type strain, is relocated at 50% in the cytoplasm of the Defl1 strain. Those datas allowed us to propose that Efl1 promots Tif6 release from 60S particles during a late cytoplasmic step of 60S biogenesis. After its release, Tif6 is recycled in nucleolus. This model is support by an in vitro test showing that Tif6 is released from 60S particles in the presence of Efl1. We have also shown with in vitro tests that Efl1 is a GTPase whose activity is linked to its binding on the GTPase center domain of ribosomes. To verify if Efl1 can act as a molecular motor to generate structural rearrangements like EF-2, we have probed this region in three contexts : wild-type, revertant and Defl1. We observed conformationnal differences on 60S particles from a Defl1 strain but they seem to be linked to the lack of Tif6 in nucleolus during 60S biogenesis. To finish, analysis by mass spectroscopy of proteinic components from 60S preparticles do not show any assembling factor deficit in the Defl1 context but allowed us to identify three unknown factors.