Recherche de cytochromes P450 impliqués dans la tolérance aux herbicides chez le blé (Triticum aestivum)

Identification of cytochromes P450 involved in herbicide detoxification in wheat (Triticum aestivum)

• Auteur / Autrice : Marc Morant
• Direction : Danièle Reichhart
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Expression génique

Blé

Cytochromes

Métabolisme secondaire

Détoxication

Herbicides

Résumé

Les cytochromes P450 sont des hémoprotéines impliquées dans un grand nombre de réactions d'hydroxylation et également connues pour la détoxification d'herbicides. Il a été montré que le blé est capable de métaboliser un grand nombre d'herbicide grâce à des P450s. Notre objectif fut d'isoler et d'exprimer dans la levure les P450s de blé les plus pertinents pour prédire le métabolisme des herbicides et de molécule en développement. Peu de séquences étaient disponibles lorsque ce travail fut initié. Nous avons testé différentes approches basée sur la PCR pour isoler de nouvelles séquences de P450s. Le '' mRNA differential display '', le séquençage d'ESTs et la conception classique d'amorce de PCR furent moins efficaces qu'une nouvelle méthode appelée CODEHOP. Cette dernière permit d'isoler plus de 100 séquences de P450 qui correspondent à plus de 50 P450s différents. 28 séquences furent choisies pour être isolées puis exprimées dans la levure. En raison d'une différence dans l'utilisation des codons entre la levure et le blé, une optimisation consistant en un recodage de l'extrémité 5' des séquences de blé fut nécessaire en utilisant pour cette région les codons les plus utilisés de la levure. Ces P450s furent testés pour leur capacité à métaboliser un groupe représentatif d'herbicide et plusieurs substrats physiologiques potentiels. Le résultat du criblage réalisé sur les herbicides fut négatif, mais plusieurs substrats physiologiques furent identifiés ou confirmés. Parmi eux, les cytochromes impliqués dans la biosynthèse d'une phytoalexine (DIMBOA) et de la linamarine et lotaustraline furent identifiés. Pour la famille CYP709, une nouvelle fonction d'hydroxylation d'acide gras fut attribuée. Nous avons également pu identifier trois P450s impliqués dans l'hydroxylation en 3' des composés de la voie des phénylpropanoides. Plusieurs nouvelles activités secondaires pour ce groupe d'enzyme furent identifiées.

Cytochromes P450 are hemoproteins generating a variety of oxygenated metabolites also involved in the detoxification of herbicides. Wheat is a major crop and was shown to metabolize a large set of herbicides in a P450-dependent manner. Our objective was thus to isolate and express in yeast the P450 genes most relevant to herbicide metabolism in wheat to help prediction of herbicide metabolism and development of new active compounds. When this work was initiated, few plant P450 coding sequences were available. We tested different PCR strategies for isolation of new P450 sequences. Differential display of reverse transcribed mRNA, EST sequencing and classical design of degenerate primers turned out less effective in our case than a recently developed method: CODEHOP. The latter led to isolation of more than 100 P450 sequences corresponding to nearly 50 different P450s. 28 sequences were selected for isolation of full-length and heterologous expression in yeast. Due to different codon usage in wheat and yeast, optimization involved the recoding the 5'-terminus of the wheat cDNA using the codons most frequent in yeast to obtain significant levels of expression. The 28 expressed P450s were tested for their ability to metabolize a set representative herbicides and potential physiological substrates. The results of the screening for herbicide metabolism were negative, but several physiological substrates were identified or confirmed using recombinant microsomes assays. Among them, wheat P450s involved in the biosynthesis of the phytoalexins DIMBOA and linamarin/lotaustralin were identified. For the family CYP709, which was not characterized before, a new function in the hydroxylation of fatty-acids was assigned. We also characterized three P450s involved in the 3-hydroxylation of phenolic compounds in Arabidopsis. Several new secondary activities were found for this CYP98 family of enzyme.