Des peptides et peptido-mimétiques ligands de récepteurs cardio-vasculaires

Peptides and peptido-mimetics ligands of cardiovascular G-protein coupled receptors

• Auteur / Autrice : Jean-Christophe Peter
• Direction : Johan Hoebeke
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Appareil cardiovasculaire

Anticorps

Électrocardiographie

Récepteurs

Protéines G

Résumé

Les récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG) représentent une grande famille de récepteurs ubiquitaires impliqués dans de nombreux processus métaboliques. Leur grande diversité d'action en fait des cibles pharmacologiques privilégiées pour le développement de médicaments avec des applications dans tous les champs d'activité clinique en particulier au niveau cardio-vasculaire. Les récepteurs 2-adrénergique (2AR) et M2 muscariniques (M2Ach-R) appartiennent à la famille des RCPG et sont impliqués dans la régulation du système cardiovasculaire. De nombreuses études ont montré l'importance de la seconde boucle extracellulaire pour l'activité de ces récepteurs dans certaines pathologies autoimmunes. La première partie du travail concerne le 2AR. Les scFvs issus d'AcM dirigés contre un peptide dérivé de la seconde boucle extracellulaire (SBE) du 2AR ont été produits. La capacité de cette protéine recombinante de reconnaître son peptide antigénique de façon spécifique a été mise en évidence, et les constantes cinétiques d'interaction ont pu être déterminées. Leur capacité à reconnaître le récepteur a été démontrée par immuno-cyto-fluorescence sur cellules A431 exprimant de façon constitutive le 2AR. Sur ces mêmes cellules, ce fragment d'anticorps est capable de façon dose dépendante de diminuer l'augmentation intracellulaire d'AMPc induite par 10 nM de salbutamol (agoniste 2), il est également capable seul de diminuer le niveau basal d'AMPc ce qui en fait un agoniste inverse. Il inhibe de façon non compétitive l'augmentation des battements spontanés de cardiomyocytes de rats nouveau-nés induits par différentes concentrations de clenbutérol (agoniste ). Des souris traitées par injections i. V. De scFv montrent une diminution du rythme cardiaque. Les peptides dérivés des CDRs du scFv 6H8 ont été synthétisés et cyclisés. Le CDR H1, totalement insoluble, n'a pu être utilisé. Les constantes cinétiques d'interaction avec le peptides dérivé du 2AR ont pu être déterminées par SPR pour le CDR L2, L3 et H3. Les CDR H2, L1 et L2 se sont révélés être des modulateurs allostériques négatifs du 2AR en inhibant de façon non compétitive l'augmentation des battements induite par une dose croissante de clenbutérol alors que les CDR H3 et L3 se sont révélés être des modulateurs allostériques positifs en augmentant l'effet du clenbutérol sur ces cellules. La deuxième partie du travail concerne la modulation de l'activité du récepteur M2 muscarinique et cela par deux approches différentes. Dans un premier temps, un lot de souris a été immunisé avec un peptide dérivé de la SBE du M2Ach-R (souris M2). Les sérums issus des souris M2 sont capables de reconnaître le M2Ach-R en immuno-empreinte. Ils sont également capables d'augmenter l'activité du carbachol sur le M2Ach-R in vitro sur des cellules CHO transfectées avec ce dernier. Pour mettre en évidence une modulation du récepteur induite par les anticorps anti-M2Ach-R, les souris ont été traitées par injection i. V. Avec plusieurs ligands muscariniques et adrénergique. Leurs ECGs ont été enregistrés et l'évolution de leurs rythme cardiaque suite à l'injection ainsi que les spectres de variabilité de leur rythme ont été calculés. Suite à l'injection de carbachol, les souris M2 diminuent plus fortement leur rythme que les souris contrôles. De plus, les souris M2 sont moins sensibles à l'injection de gallamine, atropine et isoprotérenol. L'analyse de l'évolution et de la variabilité de leur rythmes cardiaques suite aux différents traitements montre une augmentation du tonus parasympathique chez les souris M2 par rapport aux souris contrôles. Les anticorps anti-M2Ach-R agissent dans ce cas comme des ligands allostériques positifs. Une deuxième approche a également permis de moduler l'activité du M2Ach-R. De la même manière que pour le scFv anti-récepteur 2 adrénergique, un scFv anti-M2Ach-R a été produit et caractérisé à l'aide de la technologie SPR. Des expériences menées in vitro sur cellules CHO transfectées avec le M2Ach-R et sur cardiomyocytes de rats nouveau-nés ont permis de mettre en évidence une activité pharmacologique sur ce récepteur. Il est capable d'inhiber de manière non-compétitive l'action d'un agoniste tel que le carbachol. De plus, seul, il est également capable de diminuer l'activité basale du récepteur ce qui fait également de ce fragment d'anticorps un agoniste inverse. Il est également capable in vivo de modifier la réponse au carbachol et à l'isoprotérénol sur l'activité cardiaque de souris via le M2Ach-R par injection i. V. . Ce travail montre que des fragments d'anticorps recombinants monovalents dirigés contre la SBE de RCPG représentent des agonistes inverses allostériques alors que des anticorps (bivalents) induits contre ce même site, sont des ligands allostériques positifs. De plus, les peptides dérivés des CDRs du scFv anti 2AR, ont gardé une activité pharmacologique sur leur récepteur cible. Outre l'aspect développement de nouvelles molécules, ces fragments d'anticorps ainsi que les peptides mimant les CDRs représentent des outils puissants pour la compréhension des mécanismes d'activation des RCPG.

G protein coupled receptor are involved in various metabolic functions. This receptor family represents the main target of cardiovascular and neurological used drugs. The 2 adrenergic receptor (2AR) and the M2 muscarinic receptor (M2Ach-R) belong to this family and are implicated in the regulation of the cardiovascular system. Many studies show the importance of the second extracellular loop of GPCR on their activity in particular in some autoimmune diseases. The first part of this work concern the 2AR. Using a functional monoclonal antibody against the human 2AR, a scFv fragment with high affinity for the target epitope was constructed and produced. The fragment recognized the ß2-adrenergic receptors on A431 cells, blocked cAMP accumulation induced by the ß2-agonist salbutamol, and decreased basal cAMP accumulation in the same cells. Their in vitro activity was tested on neonatal rat cardiomyocytes. The antibody fragments blocked the chronotropic activity induced by the ß2-agonist clenbuterol. They also decreased the in vivo heart beating frequency of mice pretreated with bisoprolol (a ß1-adrenergic receptor antagonist) for 4 minutes after injection. Cyclic peptides derived from the CDR of the scFv 6H8 were produced. The CDR H1 was not used because of its total insolubility in water. Kinetic contants of interaction with their target peptides were determined by SPR technology for the CDR peptides L2, L3 and H3. The CDR H2, L1 et L2 behaved as negative allosteric modulator of the 2AR, they inhibited in a non competitive manner the increase of spontaneous beating rate of neonatal rat cardiomyocytes induced by an increasing dose of clenbuterol. The CDR H3 and L3 behaved as positive allosteric modulators of the 2AR by increasing the clenbuterol effect on these cells. The second part of this work concern the modulation of the M2Ach-R activity using two different strategies. First, we investigated the in vivo consequences on heart rate of such antibodies in mice immunized with a peptide derived from the second extracellular loop of the M2AChR. Nine mice, immunized with a peptide corresponding to the N-terminus of the second extracellular loop of the M2AChR were compared to 9 mice immunized with an irrelevant peptide. Sera of mice immunized with the M2ACh-R derived peptide recognized the M2ACh-R on immunoblots and enhanced the agonist activity of carbachol towards the M2AChR transfected in CHO cells. In vivo, no difference could be shown in heart rate nor in heart rate variability between the two groups of mice. In contrast, the decrease in heart rate induced by carbachol was more pronounced in the M2AChR immunized mice compared to the control mice. The increase in heart rate induced by atropine, gallamine and isoproterenol were alike significantly attenuated in the M2ACh-R immunized mice compared to the control mice. Analysis of heart rate variability further argued for an increased parasympathetic response to the different drugs in the M2ACh-R immunized mice. Antibodies raised against the M2AChR can behave as positive M2AchR allosteric modulators in vivo. They might be protective in boosting the activity of the parasympathetic drive to the heart, in particular in patients with a high sympathetic tone. The second strategy was, to construct and produce a single chain variable fragment, from a partial agonist monoclonal antibody directed against the M2ACh-R. It showed high affinity for its target epitope. The fragment is able to recognize its receptor on Chinese hamster ovary cells transfected with the M2ACh-R, to block the effect of carbachol on this receptor and to exert an inverse agonist activity on the basal activity of the receptor. The antibody fragment is also able to increase the basal rhythm of cultured neonatal rat cardiomyocytes, and to inhibit in a non-competitive manner the negative chronotropic effect of carbachol. This antibody fragment is able to exert its inverse agonist activity in vivo on mice heart activity. This works shows that recombinant monovalent antibody fragments directed against te second extracellular loop of GPCR have inverse agonist activity. Bivalent antibodies directed against the same target, show an allosteric positive activity on the receptor. Peptides derived from CDR of the scFv 6H8, keep a pharmacological function, they act as allosteric modulators of the 2AR. These scFv and cyclic peptides may represent leads for a new class of allosteric modulators of GPCR. They also represent tools for understanding of the activation mechanisms of GPCR.